分析化学发光/鲁米诺

B1. 鲁米诺

B1a. 概述

鲁米诺是 5-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮（常称为 3-氨基邻苯二甲酰肼）的通用名称。鲁米诺的氧化产生激发的 3-氨基邻苯二甲酸酯，它在弛豫时发射光（λ_max = 425 nm），量子产率约为 0.01； 关于使用鲁米诺的危害信息可在美国国家毒理学计划的网站上获得 [1]。该反应由催化过程触发，通常是酶促过程，例如由含血红素的蛋白质提供，特别是辣根过氧化物酶（HRP，EC 1.11.1.7）。在过氧化氢的存在下，该酶转化为中间体复合物，然后再生。它在生物学工作中具有明显的优势，允许鲁米诺反应在低至 8.0 到 8.5 的 pH 值下进行。HRP 可用作标签来检测目标分析物，鲁米诺化学发光可用于检测产生过氧化氢的氧化酶的底物。酶催化将在 B1f 部分（添加链接）中全面讨论。催化剂可以是化学的而不是酶促的（例如，过渡金属阳离子或络离子，例如，高 pH 值下的铁氰化物）。金属离子催化将在 B1e 部分（添加链接）中全面讨论。

或者，鲁米诺化学发光可以通过电化学方式触发。Sakura 建议鲁米诺在电极表面被氧化，然后它可以与过氧化氢反应，每个过氧化氢分子产生一个光子（与 HRP 催化反应中的 0.5 相比），从而实现更灵敏的检测，并避免酶方法的脆弱性。 鲁米诺电化学发光将在 B1d 部分（添加链接）中全面讨论。

已经设计了许多测定化合物的分析方法，这些方法通过抑制、增强或催化鲁米诺化学发光来进行。检测限达到亚飞摩尔水平，但化学的通用性限制了它的选择性。这对体液或天然水等非常复杂的样品来说是一个严重的缺点；在某些情况下，一种分析物可能增强鲁米诺反应，而另一种分析物则抑制它，由此产生的信号是难以解释的多种效应的组合。在过程分析化学中，情况要容易得多，因为可能只存在一种预期分析物。将化学发光反应与分离步骤（液相色谱或毛细管电泳）（添加链接）后柱联用可以克服干扰，并提供飞摩尔-皮摩尔检测限。在分离前用鲁米诺标记样品成分可以达到同样的目的。选择性也可以通过将鲁米诺反应与酶促反应或抗体检测或分子印迹聚合物的识别相结合来提供。

已经合成了许多鲁米诺的类似物； 其中一些比鲁米诺本身产生更强烈的化学发光，但前提是修饰仅限于鲁米诺分子的苯环。对杂环的改变会消除化学发光。邻苯二甲酰肼（没有胺取代基的鲁米诺）除了在非质子溶剂中外，不具有化学发光性。

B1b. 机制

图 B1.1 - 鲁米诺初级氧化的一电子和两电子途径导致二级氧化和化学发光。

Roswell 和 White 提出了鲁米诺氧化化学发光的机制； 一些单独的步骤已被 Lind、Merenyi 和 Eriksen 研究。 图 B1.1 是该机制的流程图；文中显示了参与鲁米诺氧化的主要化学物质的结构及其缩写。该模型提出鲁米诺二氮杂醌过氧化氢阴离子 (LOOH^–) 的两步形成，它们自发分解（通过三环内过氧化物过渡态）形成二氮和激发的 3-氨基邻苯二甲酸酯阴离子，从而发光。通过该途径的鲁米诺氧化量子产率很高，从而获得良好的分析灵敏度。

b(i) 鲁米诺的初级氧化

过氧化氢中间体 (LOOH^–) 是通过鲁米诺单阴离子 (LH^–) 的初级氧化形成的，它先被氧化成自由基 (L^•–)，然后加成超氧化物 (O₂^•–)，或者先被氧化成二氮杂醌 (L)，然后加成过氧化氢阴离子 (HO₂^–)。

(a) 鲁米诺 (LH₂) 在 pH 值为 10.0 的水溶液中以单阴离子 (LH^–) 的形式存在，它们通过一电子氧化（例如，通过羟基自由基 (HO^•, E⁰ = +2.8 V)）形成二氮杂半醌自由基 (L^•–)，其形成速度很快（k = 9.7 x 10⁻⁹ dm³ mol⁻¹ s⁻¹）

1) LH^– – e^– → LH^• （例如，LH^– + HO^• → L^•– + H₂O）

(b) 鲁米诺单阴离子的两电子氧化（例如，用过氧化氢）生成二氮杂醌 (L)，

2) LH^– – 2e^― → L + H⁺ （例如，LH^– + H₂O₂ → L + H₂O + HO^–）

两电子氧化在鲁米诺-过氧化氢反应开始时发生。在过氧化氢与鲁米诺竞争羟基自由基转化为 HO₂^• 之前，不存在超氧化物，HO₂^• 在高 pH 值下迅速去质子化形成 O₂^•–（pK_a = 4.8）

3) H₂O₂ + HO^• → O₂^•– + H₃O⁺ 羟基自由基与鲁米诺反应将单阴离子 (LH^–) 转化为 L^•– 或 LH^•，具体取决于 pH 值；这是一个单电子氧化过程。第二个电子的转移形成二氮杂醌，只有在没有超氧化物的情况下才会发生，否则超氧化物会与 L^•– 或 LH^• 反应形成鲁米诺二氮杂醌过氧化氢阴离子 (LOOH^–)。

初级氧化步骤通常决定发光速率，因此鲁米诺化学发光实际上测量了氧化剂进行该反应的能力，但其他因素也会影响初级氧化的速率。鲁米诺与过氧化氢之间的反应产生的光发射可以由钴 (II) 的存在诱导，钴 (II) 的浓度低到可以被认为是催化的，并且有人提出钴 (II) 过氧化物络离子可以引起鲁米诺的初级氧化。

b(ii) 鲁米诺的二级氧化

在分析鲁米诺化学发光中，鲁米诺的初始氧化是速率决定步骤。但化学发光也取决于超氧化物或过氧化氢离子对二级氧化的可用性。因此，使用脉冲辐射分解进行了实验以进行初级氧化，从而允许在脉冲之间的停顿时间内研究二级氧化的速率。通过一电子初级氧化形成的质子化的二氮杂半醌自由基 (LH^•) 添加到超氧化物自由基 (O₂^•–) 中，形成二氮杂醌过氧化氢 (LOOH^–)

1) LH^•– + O₂^•– → LOOH^–

此反应消耗超氧化物自由基阴离子，并且在过量过氧化氢存在的情况下，消耗大部分 LH^•。然而，LH^• 也可以自发重组。在没有超氧化物的情况下，所有鲁米诺自由基都通过重组消耗，其中至少 80% 是由二聚化引起的。二氮杂醌 (L) 是鲁米诺双电子初级氧化产物，通过添加氢过氧化物阴离子转化为过氧化物。

2) L + HO₂^– → LOOH^–

b(iii). 氢过氧化物中间体的分解

二级氧化之后，环状氢过氧化物中间体分解成 3-氨基苯二甲酸，在弛豫到基态时会发出光。

LOOH^– → 3-氨基苯二甲酸 + N₂ + hν

碱性过氧化物加合物 (LOOH^–) 分解形成氨基苯二甲酸发射体的激发态，而质子化的加合物则会发生非化学发光的副反应，形成不同的黄色产物，即所谓的“暗反应”。 LOOH^– 的吸收光谱以与发光强度相同的速率衰减。发射强度随着 pH 值的升高而增加，在 pH 值约为 11 时达到最大值，这反映了 H₂O₂ 越来越多的解离成其阴离子和暗反应的重要性降低。pH 值超过 11 后，光输出降低反映了发射体荧光量子产率 (Φ_FL) 的降低。

b(iv) 化学发光量子产率的测定

Lind 和 Merényi 已经测量了鲁米诺通过放射源产生的羟基自由基发生单电子氧化产生的几种化学发光反应的光产率。利用从电离粒子到水介质的 100 eV 传递，可以通过 Φ_CL = G(hν)/ Φ_CLG_OH 来计算 Φ_CL。他们提出了一种标准，用于通过脉冲辐照引发鲁米诺化学发光，该标准由 10⁻³ mol dm⁻³ 的水性鲁米诺溶液组成，pH = 10.0，用 10% O₂ 和 90% N₂O 饱和。在定义了具有明确光输出的标准后，就可以相对于该标准确定任何其他鲁米诺反应的化学发光量子产率。Merényi 和 Lind 通过将积分光强度绘制成放射剂量（与羟基自由基浓度呈线性关系）的函数来完成此操作。通过比较图的斜率获得光产率，从而获得相对量子产率。

B1c. 鲁米诺化学发光中使用的氧化剂

c(i). 过氧化氢

过氧化氢在分析上是鲁米诺最有用的氧化剂，但需要电极、金属离子或酶的催化作用。例如，它在钴 (II) 催化剂存在的情况下，在水性介质中很容易与鲁米诺反应。该反应是在 0.1 mol dm⁻³ 的碳酸盐缓冲液 (pH 值在 10 到 11 之间) 中使用等体积的 0.1 mol dm⁻³ 过氧化氢和 1.0 × 10⁻³ mol dm⁻³ 鲁米诺溶液进行化学发光的非常有效的台式演示。一些金属离子，如铁 (II)，用于催化鲁米诺的氧化，与过氧化氢反应：Fe²⁺ + H₂O₂ → Fe³⁺ + HO^• + HO^– 生成羟基自由基（芬顿反应），羟基自由基具有非常强的氧化性能，因此可以引发鲁米诺的初级氧化。但它们也与过氧化氢（方程 1）和氢过氧化物离子（方程 2）反应：1) H₂O₂ + HO^• → O₂^•– + H₃O⁺ 2) HO₂^– + HO^• → O₂^•– + H₂O 这些反应中羟基自由基的消耗降低了初级氧化的速率，但超氧化物的生成增加了二级氧化的速率。

c(ii). 氧气

鲁米诺自由基还原为单阴离子 (LH^• + e⁻ → LH⁻) 的标准还原电位 (E⁰) 已被确定为 +0.87 V。 由分子氧 (E⁰ = 1.229 V) 氧化在热力学上是可能的，但在水溶液中，反应活性在任何 pH 值下都不可检测 (k = 10⁻⁸ dm³ mol⁻¹ s⁻¹)，因此该反应不适用于初级氧化。人们普遍认为，即使在 pH = 14 时，空气饱和的鲁米诺溶液在黑暗中也是无限期稳定的。尽管如此，溶解在水溶液中的氧气氧化鲁米诺的现象经常被报道。在这种情况下，可能是指由氧自由基氧化，氧自由基可能是由合适的还原剂（如金属离子）从分子氧中形成的。这种现象在第 D10 章中讨论，以及其他氧自由基作为化学发光试剂的情况（链接）。

在二甲基亚砜 (DMSO) 溶液中，鲁米诺以二阴离子的形式存在，并在强碱存在的情况下与溶解的氧气反应，产生强烈的化学发光。 该反应的速率常数约为 50 dm³mol⁻¹s⁻¹； 氧气与鲁米诺二阴离子在碱性水溶液中发生类似反应的速率常数为 10⁻² dm³ mol⁻¹ s⁻¹。由于在 DMSO 溶液中反应条件相对简单，这种现象作为演示得到了广泛的认可， 因为在室温下摇晃一瓶碱性 DMSO 中的少量鲁米诺就会发生反应。然而，虽然鲁米诺在水溶液中的氧化在分析中得到非常广泛的应用，但还没有使用 DMSO、二甲基甲酰胺或其他有机溶剂中的反应建立的分析程序，但已经研究了各种金属配合物对 DMSO 中反应的影响 发射体（3-氨基苯二甲酸离子）在非质子溶剂（如 DMSO）中互变异构为醌式结构，在 510 nm 处发出最大发射；这种互变异构体受鲁米诺阴离子与金属阳离子（如 Na⁺ 或 K⁺）配对的青睐。如果鲁米诺在混合溶剂中氧化，与水性介质相比，在 425 nm 处发射较少（离子对减少），在 510 nm 处发射更多。同样在混合溶剂中，化学发光中 425 nm 的发射比荧光中的发射少，因为在化学发光中，离子对的比例由过渡态决定，而不是由荧光中基态平衡决定。

c(iii). 锰的高氧化态

高锰酸根离子在热力学上很容易氧化鲁米诺 (E⁰ = 1.70 V)。已经报道了一种基于抑制鲁米诺-高锰酸盐化学发光的对乙酰氨基酚在药物制剂中的流动注射分析方法。 早些时候，人们制造了一种新颖的尿素生物传感器，其中脲酶催化水解产生的碳酸铵被用来从阴离子交换柱中释放鲁米诺，然后与从第二个柱中洗脱的高锰酸盐反应，产生化学发光。 随后，鲁米诺-高锰酸盐体系的许多新应用不断涌现。

在碱性高锰酸钾的作用下，鲁米诺被氧化生成锰酸根离子（VI），锰酸根离子进一步与鲁米诺反应产生化学发光。这种现象被作者称为“二次化学发光（SCL）”，并已应用于镍（II）离子的测定方法中。 在合适的流动注射系统中，将稀碱性鲁米诺溶液与水溶性高锰酸钾溶液混合，并使其反应足够长的时间，使产生的化学发光下降至接近于零的稳定最小值。然后将样品注入混合物中，如果存在镍离子，则光发射会重新开始并迅速上升至一个明确的峰值，然后恢复到基线强度。通过使用十倍过量的鲁米诺（超过高锰酸钾）在 0.1 mol dm⁻³ 的水溶性氢氧化钠溶液中并以 pH 5.10 注入样品，可以获得最佳的二次化学发光强度；建立了与镍（II）浓度的线性关系，检测限为 0.33 μg dm⁻³。发现许多二价和三价金属离子以及硝酸根离子会干扰测定。鲁米诺-锰酸根（VI）化学发光的机理似乎与其他鲁米诺氧化反应相同，其中产生激发的 3-氨基邻苯二甲酸根离子，在 425 nm 处发射光。但高锰酸盐和锰酸根（VI）的氧化都可能导致激发的锰（II）的形成，这将是化学发光的另一个来源。不幸的是，在所描述的工作中，化学发光光谱仅观察到 490 nm，忽略了这些可能对信号的贡献。

c(iv) 银(III)

一种相当稳定的银(III) 络阴离子，二过碘酸银(III) (DPA)，[Ag (H₂IO₆)(OH)₂]²⁻，可以很容易地合成。 在碱性水溶液中观察到鲁米诺与二过碘酸银之间的新的化学发光反应。 该反应发光被铁纳米粒子强烈增强，加入氨茶碱后发光强度进一步增强。 这构成了测定方法的基础，在该方法中，化学发光信号与人血清中氨茶碱浓度在 1.0 x 10⁻⁸ 到 2.0 x 10⁻⁶ mol dm⁻³ 范围内呈线性关系。检测限为 9.8 x 10⁻⁹ mol dm⁻³。在 8.0 x 10⁻⁷ mol dm⁻³ 时的相对标准偏差为 4.8% (n = 10)。

青霉素类抗生素也被发现能增强鲁米诺-银(III) 络合物的化学发光，这构成了用于药物剂型和尿液样品中这些药物的灵敏流动注射测定方法的基础。在优化的条件下，苯唑西林钠的检测限为 70 ng cm⁻³，阿莫西林的检测限为 67 ng cm⁻³，氨苄西林的检测限为 169 ng cm⁻³，克罗西林钠的检测限为 64 ng cm⁻³。

发射光线的最大波长约为 425 nm， 这是由鲁米诺氧化产生的激发的 3-氨基邻苯二甲酸盐通常产生的化学发光。这意味着银(III) 络合物能够实现 Shi 等人提出的鲁米诺的一级和二级氧化，他们推测每个二过碘酸银对两个鲁米诺分子进行单电子一级氧化。也许一个鲁米诺分子进行双电子氧化更可能。二过碘酸银(III) 离子的还原电位为 +1.74 V， 足够高，可以进行双电子氧化，将水转化为过氧化氢 (ε⁰ = -1.763 V；能斯特方程表明过氧化氢的平衡浓度为毫摩尔)。这为二级氧化和一级氧化提供了一种可能的机制。

B1d. 电化学发光

电化学发光 (ECL) 的仪器在 D7 章中介绍。由此产生的反应途径适合通过改变施加的电压或选择的电极来控制发射，并且适用于接近中性 (pH 8.0 到 8.5) 的水溶液，如生物液体，而鲁米诺化学发光通常在强碱性或非水溶液中发生。有人提出，鲁米诺首先在电极表面被氧化，然后与过氧化氢反应，化学发光量子产率（参见 A1 章 ADD LINK）得到增强。 早期应用的典型例子是使用玻璃碳电极在 ECL 条件下测定脂质氢过氧化物。 在施加 0.5-1.0 V 的电压下，鲁米诺单阴离子失去一个电子生成二氮杂半醌，二氮杂半醌歧化生成二氮杂醌，二氮杂醌与分析物定量反应。在施加 1.0 V 以上的电压下，二氮杂醌的 –NH2 和分析物本身都被氧化，分别生成 –NH• 和超氧化物，这会导致干扰信号。在优化的条件下，检测限为 0.3 nmol，S/N = 1.5。在施加于铂电极的 0.5-1.0 V 电压下，亚油酸甲酯氢过氧化物 (MLHP) 和鲁米诺都被氧化；MLHP 的检测限为 0.1 nmol，S/N = 2.5。与之密切相关的亚油酸羟基十八碳二烯酸甲酯（亚油酸氢过氧化物的还原产物）没有发射。抑制鲁米诺氧化的 ECL 信号可以用作测定抑制剂的方法。最近的一个例子是在乳制品和餐具中测定三聚氰胺。 在高 pH 值的磷酸盐缓冲液中使用低电压扫描速率，在 1.47 V 处观察到 ECL，并且 ECL 线性（r²=0.9911）下降，与三聚氰胺浓度的对数成正比，范围为 1 到 100 ng cm⁻³。检测限为 0.1 ng cm⁻³，回收率高。信号来自活性氧（来自羟基离子的电氧化）与鲁米诺的反应，而活性氧被三聚氰胺消除。电极的修饰现在是控制 ECL 的一种成熟方法，近年来，使用纳米材料进行这种修饰变得越来越重要。一个涉及鲁米诺的例子是用多壁碳纳米管和全氟磺酸聚合物 Nafion 的复合材料修饰金电极。 在碳酸盐缓冲液中进行循环伏安法时，获得了三个 ECL 峰，其强度比未修饰电极高 20 倍；在每种情况下，发射体都被确定为 3-氨基邻苯二甲酸根阴离子，表明这种改进是由于电极效率而不是系统化学的任何变化。

已经制造出 ECL 免疫传感器，已成功应用于测定血清中人免疫球蛋白 G (hIgG)。将主要抗体，生物素偶联山羊抗人 IgG，首先固定在用链霉亲和素包覆的金纳米粒子 (AuNPs) 修饰的电极上。传感器是由 hIgG 与标记有鲁米诺功能化 AuNPs 的第二抗体偶联形成的夹心型免疫复合物。ECL 由碳酸盐缓冲液（含有 1.0 mmol dm⁻³ 过氧化氢）中的双电位阶跃产生。许多鲁米诺分子附着在每个 AuNP 的表面，并作为每个抗体分子多个光发射源。这种方式的 ECL 放大与通过生物素-链霉亲和素系统连接的分析物相结合，导致信号大大增强。检测限为 1 pg cm⁻³ (S/N = 3)，超过了所有先前 hIgG 测定方法的性能。

通过在玻璃碳电极表面上制备 L-半胱氨酸还原氧化石墨烯复合材料，并在其上自组装 AuNPs，对玻璃碳电极表面进行修饰。随后将胆固醇氧化酶 (ChOx) 吸附在 AuNP 表面，形成具有令人满意的重现性、稳定性和选择性的胆固醇生物传感器。AuNPs 增加了电极的表面积，因此允许更高的 ChOx 负载，并提供更有利于 ECL 的纳米结构，从而提高分析性能。传感器的胆固醇线性响应范围为 3.3 x 10⁻⁶ 到 1.0 x 10⁻³ mol dm⁻³，检测限为 1.1 x 10⁻⁶ (S/N = 3)。

通过在丝网印刷金电极上电聚合制造的聚（鲁米诺-3,3',5,5'-四甲基联苯胺）共聚物大大提高了过氧化氢的 ECL。通过将胆固醇氧化酶固定在聚合物上，制造出适合分析血清样品的胆固醇生物传感器。在优化的条件下，生物传感器具有 2.4 x 10⁻⁵ 到 1.0 x 10⁻³ mol dm⁻³ 的线性动态范围，检测限为 7.3 x 10⁻⁶ mol dm⁻³。精度（以相对标准偏差衡量）在 5.0 x 10⁻⁴ mol dm⁻³ 时为 10.3%，该方法还具有成本低、速度快的优点。