生物实验室技术/细胞分离

细胞分离

目的

细胞分离是一种标准程序，用于根据细胞在离心机中不同的分离方式来分离亚细胞器。细胞器在离心机中根据密度、形状和大小分离。细胞核通常是第一个在离心机中沉淀的细胞器。

细胞分离中最重要的设备是离心机。离心机是一种高速旋转的设备，对旋转的物体施加向心力。离心机中的所有粒子都会感受到相同的力，但密度较大的粒子会在液体中移动得更快，并以比密度较低的粒子更小的力沉淀下来。

离心加速度（或向心加速度）通常用重力加速度的倍数表示。例如，如果离心机施加的力与重力施加的力相同，则表示为 1 G。如果它施加的力是重力的 10 倍，则表示为 10 G。相对离心加速度（通常称为相对离心力）可以使用公式 RCF= (r X RPM² X (2π)² * (100/36))/(1000² X g) 计算，其中

• r = 样品距离心机中心的半径，以厘米为单位
• RPM = 每分钟转数
• g = 重力常数 (9.8 m/s²)

此公式通常简化为 RCF = 11.19 X r X (RPM/1000)²

如果您的离心机无法获得指定的 RCF，则可以通过更长时间离心来弥补。例如，如果一个程序要求以 10,000G 的 RCF 离心 60 秒，但您的离心机只能获得 9,000 G，则可以通过离心 67 秒来弥补。确定所需补偿时间的公式为：t_r = (t_s X RCF_s)/RCF_max，其中

• t_r = 您离心机所需的时间
• t_s = 说明书中规定的时间
• RCF_s = 说明书中规定的 RCF
• RCF_max = 您的离心机可以获得的最大 RCF

差速沉降

细胞器的分离是可能的，因为粒子往往以不同的速率沉降。有几个因素决定沉降速率。

• 密度：在所有其他条件相同的情况下，粒子密度越大，沉降速度越快。然而，如果粒子的密度与样品中液体的密度相同，则它根本不会沉降。但是，如果粒子比液体介质密度低（例如，油脂和脂类放置在水中时），它会移动到介质的顶部。
• 尺寸：在所有其他条件相同的情况下，粒子越大，沉降速度越快。如果两块尺寸不同但密度相同的岩石从船上掉下来，较大的岩石往往会更快沉没。这是因为有更多的质量（假设密度相同）可以受到重力的作用。较大的质量更容易克服水的摩擦并更快下沉。这并不意味着重力对不同的质量作用不同。这只是另一种描述它所经过的介质作用的方式。一根羽毛会比一袋羽毛掉得慢。然而，在真空中，它们会以相同的速度下落。
• 粘度：液体介质的粘度（或厚度）会减缓沉降速度。如果两个粒子的尺寸和密度比较接近，并且只有很小的差异，则可以通过增加液体介质的粘度来将它们分离。

此过程允许分离细胞核、线粒体和细胞膜。

所需 材料

试剂

分离缓冲液

• 250 mM 蔗糖（约 4.28g 在 50 mL 中）
• 20 mM HEPES（pH 7.4）
• 10 mM KCl（0.0373 g 在 50 mL 中）
• 1.5 mM MgCl₂
• 1 mM EDTA
• 1mM DTT
• 蛋白酶抑制剂（1X 浓度）

• 注意：仅在使用时添加 DTT 和蛋白酶抑制剂！

实验室设备

• (1) 10 厘米培养皿
• (3) 1.5 毫升 Eppendorf 管（管子的确切数量取决于所需的馏分）
• (1) 25 Ga 针头
• (1) 1 毫升注射器
• (1) 冰块容器（孵育）
• (1) 一套微量移液器
• (1) 超声波清洗器
• (1) 离心机，能够

   --- 720 G (for nuclear fraction) 
   --- 10,000 G (for mitochondrial fraction)
   --- 100,000 G (for cell membrane fraction)