普通生物学/遗传学/重组DNA技术
普通生物学 | 入门 | 细胞 | 遗传学 | 分类 | 进化 | 组织和系统 | 补充材料
- 彻底改变了现代生物学
- 体外操纵基因的能力
- 杂合基因，包括组合不同物种的基因
- 对基因功能的详细研究
- 确定基因及其调节因子的核苷酸序列（推断蛋白质的氨基酸序列）
- 基因组计划：超过 40 个基因组的完整核苷酸序列，包括人类基因组
- 由以下因素的汇聚而成为可能
- 限制性内切酶的发现
- 细菌及其质粒的遗传学
- 用途
- 对基因功能的详细研究
- 稳态，对压力的反应
- 发育（出生缺陷）
- 基因的进化反映了生命进化的信息
- 人类福祉
- 医学
- 识别和治疗遗传疾病
- 分子医学：根据推断的氨基酸序列，设计更好的药物
- 食品
- 提高作物产量，抗病性
- 改善营养价值
- 法医
- DNA指纹识别：判定有罪或无罪
最初在细菌中发现，以防止病毒DNA入侵，切割未甲基化的双链DNA，不会切割新合成的DNA，因为它半甲基化，是DNA半保留复制的产物
- 为了结合外源DNA，切断两条多核苷酸链的磷酸二酯键
- 产生限制性片段（限制性消化）
- 末端有5'磷酸和3' –OH
- 通常具有核苷酸特异性靶序列
- 最常见的为4-6个碱基对，碱基对越多，重组的特异性就越高
- 在序列中或附近切割
- 末端
- 粘性末端=突出末端，5'或3'
- 平末端-直切，在高连接酶的存在下会与任何其他平末端退火
- 数百种已知的限制性内切酶，通常以发现它们的细菌命名
- 例如 EcoR1、Alu1、BamHI、HindIII
基因克隆
- 克隆
- DNA的限制性消化
- 将限制性片段插入克隆载体中
- 细菌质粒
- 细菌病毒
- 酵母人工染色体
- 用重组质粒或病毒转化细菌
- 使用报告基因或抗生素暴露后的抗性筛选感兴趣的克隆
- 确定核苷酸序列并根据遗传密码推断氨基酸序列
- 提交给GenBank（可在WWW上获取）
- 操纵基因以研究其功能
- 体外
- 体内
- 转基因（重组）生物
- 敲除生物
- 医学和商业用途
- 聚合酶链反应（Mullis）
- 无需克隆即可扩增目标DNA
- 目标量可以是单个分子
- 扩增的DNA可以被测序、克隆等
- Southern印迹
- 用于识别携带特定基因的限制性片段
- 也用于DNA指纹识别和RFLP分析
- cDNA构建
- 从mRNA模板反转录
- 使用SNP（单核苷酸多态性）和DNA序列重复的DNA指纹识别的基础
- 许多用途
- 使用多个探针的刑事案件
- 亲子鉴定
- 物种鉴定
- 基因进化
- 物种进化
- 使用双脱氧核苷酸（ddNTP）、模板链、DNA聚合酶1（也称为Kornberg酶）和dNTP
- 缺少用于亲核攻击的3'-OH以进行延伸
- 在双脱氧核苷酸被掺入DNA片段后，DNA合成停止
- ddNTP与dNTP的比例决定终止的可能性
- 使用32P标记的ddATP的手工方法和4个试管-ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP
- 使用在毛细管中用荧光染料标记的ddNTP的自动化方法
- 通常在商业上进行
典型机器
- 2小时测序运行
- 每个样本600-1000个碱基
- 多个样本
- 每天最多500,000个碱基（12小时）
- 数据由计算机处理
- 在大型实验室中，测序反应也实现了自动化
- 确定整个基因组的完整核苷酸序列
- 已测序的超过 40 个基因组
- 幽门螺旋杆菌
- 大肠杆菌
- 酿酒酵母
- 秀丽隐杆线虫
- 果蝇
- 智人（第一个粗略草案）
- 计算机根据基因的特性（例如，起始/终止密码子、内含子等）识别所有基因。
- DNA片段的微阵列，邮票大小；可能很昂贵，但成本已下降
微阵列芯片包含编码特定基因的DNA孔，利用与感兴趣基因杂交的概念来查看基因是否表达或是否存在。
- 旨在检测
- 突变基因（SNP）
- 表达的基因
- 即时DNA图谱（“GATTACA”）
- 医学
- 基因替代疗法的风险和知情同意
- 人类基因库的改变
- 父母的选择
- 隐私
- 转基因食品
- 安全
- 标签
- 法医
- 强制性检测
- 可靠性标准
- 研究和操控基因的技术被授予专利（例如，克隆和 PCR）。
- 基因应该被授予专利吗？
- 它们是发现者的知识产权吗？
- 它们不属于我们所有人吗？
- 土著人民是否应该因从他们当地的植物和真菌中提取的有用基因获得补偿？
- 来自早期胚胎的全能细胞
- 可以生长成任何组织或细胞类型
- 可以引入重组基因
- 在分析小鼠基因表达方面有相当大的应用
- 可能在人类中用于治疗
- 非常有争议
本文档基于克利夫兰州立大学的 Paul Doerder 博士慷慨捐赠的笔记。