生命科学方法与概念/琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳用于根据核酸的长度分离核酸。通过施加电场，带负电荷的核酸在琼脂糖基质中移动。分子的迁移率与其长度的对数成反比，这意味着小的 DNA 或 RNA 片段比大的片段迁移得更快。
分离后，核酸被染色，然后可以在紫外线下观察。通过将迁移距离与 DNA 大小标记进行比较，可以估计片段的大小。为了在进一步的程序中使用，可以从凝胶中提取片段。
琼脂糖是一种多糖聚合物材料，通常从海藻中提取。它是一种线性聚合物，由通过 α-(1→3) 和 β-(1→4) 糖苷键连接的交替的 D-半乳糖和 3,6-脱水-L-半乳糖吡喃糖组成。
每个琼脂糖链约包含 800 个单体，并且琼脂糖聚合物链形成螺旋纤维，这些纤维聚集形成超螺旋结构。当凝固时，纤维形成直径范围为 50 纳米至 >200 纳米的通道的三维网格，具体取决于所用琼脂糖的浓度。3-D 结构通过氢键保持在一起，因此可以通过加热回流至液态而破坏。
琼脂糖通常以 0.5 到 2% (w/v) 的浓度使用。应根据预期片段的大小调整浓度。对于小片段，在高琼脂糖浓度下分辨率更好，而较低的浓度有助于分离大分子。可以从下表中获取建议。
| 琼脂糖浓度为 %(w/v) | 线性 DNA 的有效分离范围 |
对于小核酸（10-1000 bp），可以使用浓度为 2-4% 的筛分琼脂糖。标准琼脂糖的凝胶温度为 35-42 °C，熔化温度为 85-95 °C。琼脂糖可以通过羟乙基化进行修饰，这种取代减少了链内氢键的数量，导致熔化和凝固温度低于标准琼脂糖。确切的温度由取代程度决定，许多可用的低熔点 (LMP) 琼脂糖类型可以在 30-35 °C 下保持液态。这种特性允许通过将包含感兴趣 DNA 的熔化凝胶片直接添加到反应混合物中来进行酶促操作。
琼脂糖聚合物含有带电荷的基团，特别是丙酮酸和硫酸盐。这些带负电荷的基团在称为电渗流 (EEO) 的过程中产生与 DNA 运动方向相反的水流，因此会阻碍 DNA 的运动并导致条带模糊。较高的凝胶浓度会导致较高的电渗流。因此，低 EEO 琼脂糖通常更适合用于核酸的琼脂糖凝胶电泳，但高 EEO 琼脂糖可用于其他用途。
通过将琼脂糖粉末溶解在合适的缓冲液（如用于电泳的 TAE 或 TBE）中来制备凝胶。在加热到接近沸点之前，将琼脂糖分散在缓冲液中。将熔化的琼脂糖充分冷却后，才能将溶液倒入铸模中，因为如果琼脂糖溶液太热，铸模可能会变形或破裂。将梳子放置在铸模中以形成用于加载样品的孔，并且凝胶应在使用前完全凝固。
凝胶凝固后，取出梳子，留下可以加载 DNA 样品的孔。在加载之前，将样品与加载缓冲液混合，加载缓冲液包含致密的化合物，例如甘油或蔗糖。这会提高样品的密度，使 DNA 能够沉到底部的孔中。加载缓冲液还包括有色染料，如溴酚蓝和二甲苯氰醇，用于监测电泳的进展。溴酚蓝的迁移速度类似于 200 bp 片段，而二甲苯氰醇的迁移速度为 4000 bp。溴酚蓝也是一种 pH 指示剂：如果它变成黄色，则缓冲液或凝胶不再是碱性的，应该更换。
在电泳过程中，板状凝胶完全浸没在缓冲液中。这种运行缓冲液与用于凝胶的缓冲液相同。最常见的类型是 Tris/醋酸盐/EDTA (TAE) 和 Tris/硼酸盐/EDTA (TBE)。TAE 的缓冲能力低，但它为更大的 DNA 提供最佳分辨率，并且不会干扰 DNA 的进一步处理。此外，它可以作为 50x 储备液储存，而 TBE 即使在低浓度下也会容易沉淀。硼酸盐也存在问题，因为 DNA 无法进一步使用，但是，TBE 的缓冲能力强。
在缓冲液中加入 EDTA 是为了失活需要二价阳离子才能发挥作用的核酸酶。
DNA 和 RNA 通常通过用溴化乙锭染色来观察，溴化乙锭插入 DNA 的碱基之间。当暴露于紫外线下时，它会发出橙色荧光（605 纳米）。与 DNA 结合后，荧光强度急剧增加，这被认为是由于碱基对之间的疏水环境造成的，因为水是一种高效的荧光猝灭剂。溴化乙锭可以在琼脂糖溶液凝固之前加入，或者可以在电泳后对 DNA 凝胶进行染色。无需脱色凝胶，但可能会产生更好的图像。溴化乙锭的检测限约为每条带 5 ng DNA。
还有其他染色方法可用；例如，GelRed、SYBR Green、亚甲蓝、亮甲酚蓝、尼罗蓝硫酸盐和结晶紫。GelRed、SYBR Green 和其他类似的商业产品被销售为溴化乙锭的更安全替代品，因为溴化乙锭已被证明在 Ames 试验中具有致突变性，尽管溴化乙锭的致癌性尚未真正确定。
GelRed 在结构上与溴化乙锭密切相关：它由两个通过线性间隔物连接的乙锭亚基组成。该物质被推销为比溴化乙锭更灵敏（每条带 0.1 ng DNA）。SYBR Green 需要使用蓝光透射仪。用结晶紫染色的 DNA 可以自然光下观察，无需使用 UV 透射仪，这是一个优势，但是它可能不会产生强烈的条带。
用溴化乙锭染色时，用紫外 (UV) 透射仪观察凝胶。标准透射仪使用 302/312 纳米 (UV-B) 的波长，但是将 DNA 暴露于 UV 辐射仅仅 45 秒就会对 DNA 造成损伤并影响后续程序，例如降低转化、体外转录和 PCR 的效率。因此，应限制 DNA 暴露于 UV 辐射的时间。使用 365 纳米（UV-A 范围）的更高波长会对 DNA 造成较少的损伤，但也会产生更弱的溴化乙锭荧光。如果透射仪可以选择多种波长，则应使用较短的波长捕获图像，而当需要长时间处理凝胶时，应使用较长的波长。
凝胶电泳后，DNA片段通常从凝胶中分离出来，用于进一步的操作。第一步是识别所需的条带并将其移除，例如使用刀片。这应该快速进行，以避免DNA因紫外线照射而损坏。从这些条带中分离和纯化DNA的方法有很多，一种常见的方法是使用试剂盒，这些试剂盒可从不同的制造商处获得。这些试剂盒中包含的方案通常要求将凝胶切片溶解在 3 倍体积的变性剂中，在 50 °C 下进行，然后将溶液应用于离心柱（DNA 保留在柱中），用 70% 乙醇洗涤（DNA 保留在柱中，盐和杂质被洗掉），最后用少量（30 µL）的水或缓冲液洗脱 DNA。