生命科学方法与概念/色谱法
色谱法是用于分离混合物的一组实验室技术的总称。混合物溶解在称为流动相的流体中，流动相将其通过包含另一种称为固定相的物质的结构。混合物的各种成分以不同的速度移动，导致它们分离。分离基于流动相和固定相之间的差异分配。化合物分配系数的细微差异会导致固定相上的差异保留，从而改变分离。
色谱法可以是制备性的或分析性的。制备色谱法的目的是分离混合物的成分以供进一步使用（因此是纯化的一种形式）。分析色谱法通常使用少量材料进行，用于测量混合物中分析物的相对比例。两者并不互斥。
离子交换色谱法（通常称为离子色谱法）根据分析物的电荷进行分离。它使用带电的固定相来分离带电的化合物，包括阴离子、阳离子、氨基酸、肽和蛋白质。在传统方法中，固定相是离子交换树脂，它带有带电的功能基团，这些功能基团与化合物的带相反电荷基团相互作用以保留。离子交换色谱法通常用于使用FPLC纯化蛋白质。
蛋白质具有许多功能基团，这些基团可以带正电荷或负电荷。离子交换色谱法根据蛋白质的净电荷进行分离，净电荷取决于流动相的组成。通过调节流动相的pH值或离子浓度，可以分离各种蛋白质分子。例如，如果蛋白质在pH 7时具有净正电荷，那么它将结合到带负电荷珠的柱上，而带负电荷的蛋白质则不会。通过改变pH值使蛋白质的净电荷为负，它也会被洗脱出来。
通过增加流动相的离子强度进行洗脱是一种更微妙的效果——它的作用是流动相中的离子将优先与固定相上的固定离子相互作用。这将“屏蔽”固定相与蛋白质（反之亦然），并允许蛋白质洗脱。
可以根据蛋白质的天然等电点进行分离。或者，可以将肽标签基因添加到蛋白质中，使蛋白质的等电点偏离大多数天然蛋白质（例如，6 个精氨酸用于结合到阳离子交换树脂，如 DEAE-Sepharose，或 6 个谷氨酸用于结合到阴离子交换树脂）。
体积排阻色谱法 (SEC) 根据分子大小（更准确地说是根据其流体力学直径或流体力学体积）分离分子。较小的分子能够进入介质的孔隙，因此，分子被捕获并从流动相的流动中去除。孔隙中的平均停留时间取决于分析物分子的有效大小。但是，大于填料平均孔径的分子会被排除在外，因此基本上不会被保留；此类物质是第一个被洗脱出来的。它通常是一种低分辨率色谱技术，因此它通常保留用于纯化的最后一步，即“抛光”步骤。它也用于确定纯化蛋白质的三级结构和四级结构，尤其是因为它可以在天然溶液条件下进行。
通常，当使用水溶液将样品通过柱时，该技术被称为凝胶过滤色谱法，与凝胶渗透色谱法不同，后者是在使用有机溶剂作为流动相时使用。
凝胶过滤色谱法的主要应用是蛋白质和其他水溶性聚合物的分级分离，而凝胶渗透色谱法用于分析有机溶性聚合物的分子量分布。这两种技术都不应与凝胶电泳混淆，凝胶电泳使用电场根据电荷“拉”或“推”分子穿过凝胶。
SEC 的一个要求是分析物不与固定相表面相互作用，分析物之间的洗脱时间差异理想情况下仅基于分析物“看到”的体积。因此，能够穿透固定相孔系统每个区域的小分子“看到”的总体积等于整个孔体积和颗粒间体积之和。这种小分子将最后洗脱出来（当孔体积和颗粒间体积通过柱子时，大约 80% 的柱体积）。在另一个极端，一个非常大的分子，它不能穿透孔系统的任何区域，只“看到”颗粒间体积（大约 35% 的柱体积），并且将在该体积的流动相通过柱子时更早地洗脱出来。SEC 的基本原理是不同大小的颗粒将在固定相中以不同的速率洗脱（过滤）。这会导致根据大小分离颗粒溶液。只要所有颗粒同时或接近同时加载，相同大小的颗粒应该一起洗脱出来。
然而，由于存在各种衡量大分子大小的方法（例如，回转半径和流体力学半径），SEC 理论中的一个基本问题一直是选择一个合适的分子大小参数，根据该参数，不同种类的大分子可以被分离。在实验中，Benoit 及其同事发现洗脱体积与几种链结构和化学成分的动态分子大小（流体力学体积）之间存在极好的相关性。观察到的基于流体力学体积的相关性被接受为通用 SEC 校准的基础。
每个体积排阻柱都有一个可以分离的分子量范围。排除限定义了柱子“工作”范围上限的分子量，在此分子量处，分子太大而无法被固定相捕获。范围的下限由渗透限定义，它定义了能够穿透固定相所有孔隙的分子量。低于此分子量的所有分子都太小，以至于它们以一个波段洗脱出来。
在末端收集的已过滤溶液被称为洗脱液。空隙体积包括任何太大而无法进入介质的颗粒，而溶剂体积被称为柱体积。
在正相色谱法中，固定相是极性的，流动相是非极性的。极性最小的化合物首先洗脱出来，极性最大的化合物最后洗脱出来。流动相由非极性溶剂（如己烷或庚烷）与稍微极性更大的溶剂（如异丙醇、乙酸乙酯或氯仿）混合组成。随着流动相中非极性溶剂量的增加，保留率会增加。
反相色谱法（也称为 RPC 或疏水色谱法）包括任何使用疏水固定相的色谱方法。
“反相”一词具有历史背景。在 20 世纪 70 年代，大多数液相色谱使用含有未改性二氧化硅或氧化铝树脂的固定相进行。这种方法现在被称为“正相色谱”。在正相色谱中，固定相是亲水的，因此对流动相中的亲水分子具有很强的亲和力。引入一种使用共价键合到固体载体的烷基链的技术，创造了一种疏水性固定相，该固定相对疏水化合物具有更强的亲和力。使用疏水性固定相可以被认为是正相色谱的相反或“反向”，因此被称为“反相色谱”。
反相色谱采用极性（水性）流动相。因此，极性流动相中的疏水分子倾向于吸附到疏水性固定相上，而流动相中的亲水性分子将穿过色谱柱并首先洗脱。疏水分子可以通过使用有机（非极性）溶剂降低流动相的极性来从色谱柱中洗脱，这会减少疏水相互作用。分子疏水性越强，它与固定相的结合越牢固，洗脱该分子所需的有机溶剂浓度就越高。
亲和色谱基于分析物与特定分子之间选择性非共价相互作用。它非常特异，但不很稳健。它通常用于生物化学中，用于纯化与标签结合的蛋白质。这些融合蛋白用组氨酸标签、生物素或抗原等化合物标记，这些化合物特异性地与固定相结合。
亲和色谱通常利用生物分子对金属（Zn、Cu、Fe 等）的亲和力。色谱柱通常是手工制备的。传统的亲和色谱柱用作制备步骤，以冲洗掉不需要的生物分子。
固定化金属离子亲和色谱 (IMAC) 基于氨基酸，特别是组氨酸与金属的特定配位共价键。该技术通过允许具有对金属离子亲和力的蛋白质保留在含有固定化金属离子的色谱柱中而起作用，例如钴、镍、铜用于纯化含有组氨酸的蛋白质或肽，铁、锌或镓用于纯化磷酸化蛋白质或肽。许多天然存在的蛋白质没有对金属离子的亲和力，因此可以使用重组 DNA 技术将这种蛋白质标签引入相关基因中。用于洗脱目标蛋白质的方法包括改变 pH 或添加竞争性分子，如咪唑。
该程序的另一种用途是从血清中亲和纯化抗体。如果已知血清含有针对特定抗原的抗体（例如，如果血清来自针对相关抗原免疫的生物体），则可以使用它来亲和纯化该抗原。这也称为免疫亲和色谱。例如，如果生物体针对 GST 融合蛋白进行免疫，它将产生针对融合蛋白的抗体，以及可能针对 GST 标签的抗体。然后，该蛋白可以共价偶联到琼脂糖等固体载体上，并在抗体从免疫血清中纯化时用作亲和配体。
为了全面起见，GST 蛋白和 GST 融合蛋白可以分别单独偶联。血清最初被允许与 GST 亲和基质结合。这将去除针对融合蛋白的 GST 部分的抗体。然后将血清与固体载体分离，并允许其与 GST 融合蛋白基质结合。这使得任何识别抗原的抗体能够被捕获在固体载体上。最常使用低 pH 缓冲液（如甘氨酸 pH 2.8）来洗脱感兴趣的抗体。将洗脱液收集到中性 Tris 或磷酸盐缓冲液中，以中和低 pH 洗脱缓冲液并阻止抗体活性的任何降解。
通常采用简化的策略来纯化针对肽抗原产生的抗体。当肽抗原在合成时产生时，在肽的 N 端或 C 端添加一个末端半胱氨酸残基。该半胱氨酸残基包含一个巯基官能团，允许肽轻松偶联到载体蛋白（例如，钥孔血蓝蛋白 (KLH)）。相同的含半胱氨酸肽也通过半胱氨酸残基固定在琼脂糖树脂上，然后用于纯化抗体。
大多数单克隆抗体已使用基于免疫球蛋白特异性蛋白 A 或蛋白 G 的亲和色谱进行纯化，这些蛋白 A 或蛋白 G 来自细菌。
亲和色谱最常见的用途可能是纯化重组蛋白。具有已知亲和力的蛋白质被蛋白质标记，以帮助其纯化。该蛋白可能已被基因改造，使其能够被选择用于亲和结合；这被称为融合蛋白。标签包括谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)、六组氨酸 (His) 和麦芽糖结合蛋白 (MBP)。组氨酸标签对镍或钴离子具有亲和力，这些离子通过与固定相中加入的螯合剂形成配位共价键而固定化。为了洗脱，使用过量的能够作为金属离子配体的化合物，例如咪唑。GST 对谷胱甘肽具有亲和力，谷胱甘肽可作为谷胱甘肽琼脂糖商购获得。在洗脱过程中，使用过量的谷胱甘肽来取代标记的蛋白质。
高效液相色谱 (HPLC) 依靠泵将加压的液体溶剂（含有样品混合物）通过装有固体吸附剂的色谱柱。HPLC 与传统的（“低压”）液相色谱的区别在于，操作压力要高得多（50-350 巴），而普通液相色谱通常依靠重力将流动相通过色谱柱。由于在分析型 HPLC 中分离的样品量很小，典型的色谱柱尺寸为 2.1-4.6 毫米直径，30-250 毫米长度。此外，HPLC 色谱柱采用更小的吸附剂颗粒（平均粒径为 2-50 微米）。这使得 HPLC 在分离混合物时具有更高的分离能力，这就是它成为一种流行的色谱技术的原因。
HPLC 仪器的示意图通常包括一个进样器、泵和一个检测器。进样器将样品混合物带入流动相流中，流动相流将其带入色谱柱。泵以所需流速和流动相组成将流动相通过色谱柱。检测器产生与从色谱柱中出来的样品组分量成比例的信号，因此允许对样品组分进行定量分析。数字微处理器和用户软件控制 HPLC 仪器并提供数据分析。HPLC 仪器中一些机械泵型号可以将多种溶剂混合在一起，比例随时间变化，在流动相中产生组成梯度。各种检测器在使用中很常见，例如 UV/Vis、光电二极管阵列 (PDA) 或基于质谱法。大多数 HPLC 仪器还具有一个色谱柱恒温箱，允许调整分离执行的温度。