生命科学方法与概念/蛋白质电泳
SDS-PAGE 是一种常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)，用于根据蛋白质的分子量分离蛋白质。十二烷基硫酸钠 (SDS) 是一种阴离子去污剂，可以使蛋白质的二级和非二硫键连接的三级结构变性，并且根据蛋白质的质量为每个蛋白质施加负电荷。除了 SDS 外，蛋白质也可以选择地在还原剂（如二硫苏糖醇 (DTT) 或 2-巯基乙醇 (β-巯基乙醇/BME)）存在下短暂加热至接近沸腾，从而通过减少二硫键进一步使蛋白质变性，从而克服某些形式的三级蛋白质折叠并破坏四级蛋白质结构（寡聚亚基）。这被称为还原性 SDS-PAGE。
凝胶通常由丙烯酰胺、双丙烯酰胺、变性剂 (SDS) 和调整过 pH 值的缓冲液组成。该溶液可以在真空下脱气，以防止在聚合过程中形成气泡。或者，可以在凝胶灌注后将丁醇添加到分离凝胶中（用于蛋白质），因为丁醇可以去除气泡并使表面光滑。为了启动聚合，添加了自由基来源和稳定剂，例如过硫酸铵和 TEMED。聚合反应由于添加的双丙烯酰胺而产生了凝胶，双丙烯酰胺可以在两个聚丙烯酰胺分子之间形成交联。双丙烯酰胺与丙烯酰胺的比例可以根据特殊目的进行调整，但通常约为 1:35。凝胶的丙烯酰胺浓度也可以改变，通常在 5% 到 25% 的范围内。较低百分比的凝胶更适合分离非常高分子量的分子，而较高百分比的凝胶则需要分离较小的蛋白质。
凝胶通常在凝胶铸造器中的两块玻璃板之间聚合，在顶部插入一个梳子以创建样品孔。在凝胶聚合后，可以取出梳子，凝胶就准备好进行电泳了。
PAGE 中使用各种缓冲液体系，具体取决于样品的性质和实验目标。在阳极和阴极使用的缓冲液可以相同也可以不同。
在凝胶上施加电场，导致带负电荷的蛋白质或核酸从负极（阴极）迁移到正极（阳极）穿过凝胶。根据其大小，每种生物分子在凝胶基质中移动的方式不同：小分子更容易穿过凝胶中的孔，而大分子则更加困难。凝胶通常运行几个小时，尽管这取决于施加在凝胶上的电压；在较高电压下迁移速度更快，但这些结果通常不如较低电压下准确。在设定的时间后，生物分子根据其大小迁移了不同的距离。较小的生物分子在凝胶中迁移得更远，而较大的生物分子则停留在接近起点的位置。因此，生物分子可以大致按大小分离，在变性条件下，大小主要取决于分子量，但在天然条件下也取决于更高阶的构象。但是，某些糖蛋白在 SDS 凝胶上的行为异常。
类似于核酸凝胶电泳，跟踪染料也经常使用。通常将已知电泳迁移率的阴离子染料包含在样品缓冲液中。非常常见的跟踪染料是溴酚蓝。这种染料在碱性和中性 pH 值下呈色，是一个小的带负电荷的分子，向阳极移动。它是一种高迁移率分子，因此它比大多数蛋白质更早移动。
大多数蛋白质分离使用“不连续”（或 DISC）缓冲液体系进行，该体系显着提高了凝胶内条带的清晰度。在不连续凝胶系统中进行电泳期间，在电泳的早期阶段形成离子梯度，导致所有蛋白质集中到一个锋利的条带中。离子梯度的形成是通过选择一个 pH 值来实现的，在该 pH 值下，缓冲液的离子与 SDS 包覆的蛋白质相比，电荷仅中等程度。这些条件提供了一个环境，其中科尔劳施定律决定了摩尔电导率。结果，SDS 包覆的蛋白质在几分钟内被浓缩到 19 μm 左右的薄区域内。在这个阶段，所有蛋白质通过等速电泳以相同的迁移速度迁移。这发生在凝胶中孔径较大的区域，因此凝胶基质在聚焦或“堆积”事件期间不会阻碍迁移。蛋白质按大小的分离是在凝胶的较低“分离”区域实现的。分离凝胶通常具有更小的孔径，这会导致筛分效应，现在决定了蛋白质的电泳迁移率。同时，凝胶的分离部分也具有一个 pH 值，其中缓冲液离子平均带更大的电荷，导致它们“超过”SDS 覆盖的蛋白质并消除离子梯度，从而消除堆积效应。
一种非常广泛的不连续缓冲液体系是 tris-甘氨酸或“Laemmli”体系，它在 pH 6.8 时堆积，在 pH 约为 8.3-9.0 时分离。该体系的缺点是这些 pH 值可能会促进蛋白质中半胱氨酸残基之间的二硫键形成，因为半胱氨酸的 pKa 范围为 8-9，并且因为加载缓冲液中存在的还原剂不会与蛋白质一起迁移。缓冲技术最近的进展通过在低于半胱氨酸 pKa 的 pH 值（例如双-tris，pH 6.5）下分离蛋白质来解决这个问题，并包括还原剂（例如亚硫酸氢钠），这些还原剂在蛋白质之前移动到凝胶中以保持还原环境。使用较低 pH 值的缓冲液的另一个好处是丙烯酰胺凝胶在较低 pH 值下更稳定，因此凝胶可以在使用前长期储存。
当施加电压时，阴离子（和带负电荷的样品分子）向下方腔室的正极（阳极）迁移，主导离子是 Cl−（高迁移率和高浓度）；甘氨酸是尾随离子（低迁移率和低浓度）。SDS-蛋白质颗粒在凝胶缓冲液的 Cl− 和阴极缓冲液的 Gly− 之间的边界处不会自由迁移。弗里德里希·科尔劳施发现欧姆定律也适用于溶解的电解质。由于 Cl− 和甘氨酸缓冲液之间的电压降，蛋白质被压缩（堆积）成微米级的薄层。边界穿过孔隙梯度，蛋白质堆积由于凝胶基质的摩擦阻力增加而逐渐分散。堆积和解堆积在梯度凝胶中不断发生，对于每个蛋白质，在不同的位置发生。为了使蛋白质完全解堆积，聚丙烯酰胺凝胶浓度必须超过 16% T。“Laemmli” 的双凝胶系统是一种简单的梯度凝胶。缓冲液的 pH 不连续性对分离质量没有显着意义，不需要具有不同 pH 的“堆积凝胶”。
考马斯亮蓝 (CBB) 是最流行的蛋白质染料。它是一种阴离子染料，可以非特异性地与蛋白质结合。CBB 的结构主要是非极性的，通常在用乙酸酸化过的甲醇溶液中使用。凝胶中的蛋白质通过乙酸固定，并同时染色。可以通过用相同的不含染料的溶液脱色来去除凝胶中过量的染料。蛋白质以蓝色条带显示在透明的背景上。由于 SDS 也是阴离子，它可能会干扰染色过程。因此，建议使用大量染色溶液，至少是凝胶体积的十倍。
考马斯亮蓝 G-250 与考马斯亮蓝 R-250 的区别在于添加了两个甲基。考马斯亮蓝 R-250 名称中的后缀“R”是红色的缩写，因为染料的蓝色略带红色。对于“G”变体，蓝色则带更多的绿色。最初，“250”表示染料的纯度。
银染是一种比传统的考马斯亮蓝染色更灵敏的蛋白检测方法。考马斯亮蓝染色通常可以检测到50 ng的蛋白条带，而银染可以将灵敏度提高50倍。银染的具体化学机制至今仍未完全清楚。银染技术由Kerenyi和Gallyas提出，是一种可以检测凝胶中痕量蛋白质的灵敏方法。该技术已扩展到对其他生物大分子进行研究，这些生物大分子已在各种支持物中分离。许多变量会影响颜色强度，每种蛋白质都有其独特的染色特性。干净的玻璃器皿、纯试剂和高纯度水是成功染色的关键。银染技术起源于14世纪，用于对玻璃表面进行染色。自16世纪以来，该技术被广泛用于此目的。早期的银染产生的颜色介于浅黄色和橙红色之间。卡米洛·高尔基完善了银染技术，用于研究神经系统。高尔基的方法随机地完整地染色了少量细胞。
等电聚焦 (IEF)，也称为电聚焦，是一种根据分子等电点 (pI) 的差异分离不同分子的技术。它是一种区域电泳形式，通常在凝胶上进行蛋白质分离，利用了目标分子总电荷与其周围环境 pH 值相关的特点。
IEF 包括将两性电解质溶液添加到固定化 pH 梯度 (IPG) 凝胶中。IPG 是丙烯酰胺凝胶基质，与 pH 梯度共聚，形成完全稳定的梯度，除了最碱性 (>12) 的 pH 值。固定化 pH 梯度是通过Immobiline比例的连续变化获得的。Immobiline 是一种弱酸或碱，由其 pK 值定义。
在低于其等电点 (pI) 的 pH 区域中，蛋白质将带正电荷，因此将迁移至阴极（带负电荷的电极）。然而，当它迁移至 pH 梯度逐渐升高的区域时，蛋白质的总电荷将减小，直到蛋白质达到与其 pI 相对应的 pH 区域。此时，它不带净电荷，因此迁移停止（因为没有对任何电极的电吸引力）。结果，蛋白质被聚焦成尖锐的固定条带，每个蛋白质都位于与自身 pI 相对应的 pH 梯度点上。该技术能够实现极高的分辨率，即使蛋白质只差一个电荷也可以被分离成不同的条带。
要聚焦的分子分布在具有 pH 梯度（通常由脂肪族两性电解质创建）的介质中。电流通过介质，创建“正”阳极和“负”阴极端。带负电荷的分子通过介质中的 pH 梯度迁移至“正”端，而带正电荷的分子迁移至“负”端。当粒子朝着与其电荷相反的极移动时，它会通过不断变化的 pH 梯度，直到到达该分子等电点的 pH 值。此时，分子不再带净电荷（由于与相关官能团的质子化或去质子化），因此不会在凝胶中继续移动。通过首先将具有不同 pI 值的小分子（如多聚两性电解质）的溶液进行电泳来建立梯度。
该方法在蛋白质研究中应用尤其广泛，蛋白质根据其酸性和碱性残基的相对含量进行分离，其值由 pI 表示。蛋白质被引入到由聚丙烯酰胺、淀粉或琼脂糖组成的固定化 pH 梯度凝胶中，其中已建立了 pH 梯度。在该过程中通常使用具有较大孔径的凝胶，以消除任何“筛分”效应，或由蛋白质尺寸不同导致的迁移速率差异而引起的 pI 伪影。等电聚焦可以分辨 pI 值相差 0.01 的蛋白质。
二维凝胶电泳，缩写为 2-DE 或 2-D 电泳，是一种凝胶电泳形式，通常用于通过二维分离蛋白质混合物，根据两个特性进行分离。
2-D 电泳从 1-D 电泳开始，但随后以与第一方向 90 度角的第二特性分离分子。在 1-D 电泳中，蛋白质（或其他分子）在一个维度上分离，因此所有蛋白质/分子将位于一条泳道上，但这些分子会在 2-D 凝胶中散开。由于两个分子不太可能在两个不同的特性上相似，因此在 2-D 电泳中，分子的分离效果比 1-D 电泳更有效。
2-D 电泳通常从等电聚焦开始。之后，蛋白质用十二烷基硫酸钠 (SDS) 处理，并根据其质量与第一个电场成 90° 角进行分离。
天然凝胶在非变性条件下运行，因此分析物的天然结构得以保持。这使得折叠或组装的复合物的物理尺寸影响迁移率，从而可以分析生物分子结构的所有四个级别。对于生物样本，仅在必要的情况下使用去垢剂来裂解细胞中的脂质膜。复合物在很大程度上保持关联和折叠，就像它们在细胞中一样。然而，一个缺点是复合物可能无法干净或可预测地分离，因为难以预测分子的形状和尺寸对其迁移率的影响。
与变性方法不同，天然凝胶电泳不使用带电的变性剂。因此，分离的分子（通常是蛋白质或核酸）不仅在分子量和固有电荷方面不同，而且在横截面积方面也不同，因此会根据整体结构的形状体验不同的电泳力。对于蛋白质，由于它们保持在天然状态，因此它们不仅可以通过一般的蛋白质染色试剂进行可视化，还可以通过特定的酶联染色进行可视化。
BN-PAGE 是一种天然 PAGE 技术，其中考马斯亮蓝染料为蛋白质复合物提供必要的电荷，以进行电泳分离。考马斯亮蓝的缺点是，它在与蛋白质结合时可以像去垢剂一样起作用，导致复合物解离。另一个缺点是可能抑制化学发光（例如，在随后的蛋白质印迹检测或活性测定中）或具有辅助基团（例如血红素或叶绿素）或用荧光染料标记的蛋白质的荧光。
CN-PAGE（通常称为天然 PAGE）在聚丙烯酰胺梯度凝胶中分离酸性水溶性和膜蛋白。它不使用带电染料，因此 CN-PAGE 中蛋白质的电泳迁移率（与电荷转移技术 BN-PAGE 相比）与蛋白质的固有电荷有关。迁移距离取决于蛋白质电荷、其大小和凝胶的孔径。在许多情况下，该方法的分辨率低于 BN-PAGE，但 CN-PAGE 在考马斯亮蓝染料会干扰进一步分析技术的情况下具有优势，例如，它已被描述为一种非常有效的微型分离技术，用于 FRET 分析。CN-PAGE 也比 BN-PAGE 更温和，因此它可以保留在 BN-PAGE 条件下解离的膜蛋白复合物的易变超分子组装体。