生命科学方法与概念/用于 DNA 操作的酶
限制性内切酶（或限制性核酸内切酶）是一种酶，它在称为限制性位点的特定识别核苷酸序列处或附近切割 DNA。 为了切割 DNA，所有限制性内切酶都会在 DNA 双螺旋的每个糖磷酸骨架上进行两次切割。
这些酶存在于细菌和古细菌中，并提供了一种防御入侵病毒的机制。 在原核生物内部，限制性内切酶选择性地切割称为限制的外源 DNA； 而宿主 DNA 受修饰酶（一种甲基化酶）的保护，该酶修饰原核生物 DNA 并阻止切割。 这些过程共同构成了限制修饰系统。
已有超过 3000 种限制性内切酶得到详细研究，其中超过 600 种可商购。 这些酶通常用于实验室中的 DNA 修饰，是分子克隆中必不可少的工具。
限制性内切酶通常分为四种类型，它们在结构上有所不同，并且在它们是否在其识别位点切割其 DNA 底物或识别位点和切割位点是否彼此分离方面有所不同。
- I 型酶在远离识别位点的位点切割，并且需要 ATP 和 S-腺苷-L-蛋氨酸 (SAM) 才能发挥作用。 它们是具有限制和甲基化活性的多功能蛋白。
- II 型酶在其识别位点或识别位点附近很短的特定距离处切割； 大多数需要镁。 它们是独立于甲基化酶的单功能（限制）酶。
- III 型酶在其识别位点附近很短的距离处切割。 它们需要 ATP（但不会水解它）； S-腺苷-L-蛋氨酸刺激反应，但不是必需的。 它们作为与修饰甲基化酶的复合体的一部分存在。
- IV 型酶靶向修饰的 DNA，例如甲基化、羟甲基化和葡糖基-羟甲基化 DNA。
II 型限制性内切酶在分子生物学中最为常见，因为它们具有明确定义的切割位点，并且不需要 ATP。 它们的识别位点通常是回文序列，长度为 4-8 个核苷酸。 从图像中可以看出，它们是同型二聚体。
限制性内切酶以它们被分离出来的细菌命名。 第一个字母代表细菌属，第二、第三个字母代表种，可以添加第四个字母来识别菌株。 来自同一细菌的酶可以通过表示隔离顺序的拉丁数字来区分。
具有相同识别序列并以相同方式切割它的限制性内切酶被称为等切酶。 异切酶是识别相同序列但以不同方式切割它的酶。
下表概述了质粒 DNA 分析和制备酶切的典型方案。
| 分析酶切 | 制备酶切 | |
| 质粒 DNA | 0.1 – 0.5 µg | 1 – 5 µg |
| 限制性内切酶 A | 0.5 µl | 1 – 2 µl |
| 限制性内切酶 B | 0.5 µl | 1 – 2 µl |
| 10x 缓冲液 | 总体积的 10% | 总体积的 10% |
| 水 | 补充至总体积 | 补充至总体积 |
| 总体积 | 10 µl | 25 – 50 µl |
| 孵育温度 | 37 °C | 37 °C |
| 孵育时间 | 10 分钟 – 2 小时 | 10 分钟 – 过夜 |
如果目的是为分子克隆创建载体，则质粒必须完全酶切，否则没有插入片段的质粒可能会被转化并导致假阳性菌落。 插入片段的酶切不太关键，因此可以更短。
一些供应商提供优化的限制性内切酶，它们都在相同的缓冲液中具有活性，并且只需要非常短的孵育时间。 对于使用经典酶进行双酶切，有必要检查它们的兼容性。
酶体积不应超过总体积的 10%，以防止由于甘油过量（限制性内切酶以 50% 甘油形式提供）导致抑制或星号活性。 限制性内切酶通常储存在 -20 °C，在不放入冰箱时应放在冰上。 它们应该是最后添加到反应中的成分。 不建议涡旋混合。
一些限制性内切酶如果 DNA 被甲基化，则无法识别它们的限制性位点。 在使用表达甲基化酶的大肠杆菌菌株时，应考虑这一点。
乙醇、EDTA、苯酚、氯仿或去污剂等污染物会干扰酶的活性，因此 DNA 应不含这些污染物。
- REBASE 是最全面的限制性内切酶数据库
- NEBcutter 在 DNA 序列中查找限制性位点
- 商业供应商的网站 NEB 和 Thermo Scientific 包含有关限制性内切酶的广泛信息
DNA 连接酶是一种酶，它通过催化磷酸二酯键的形成来促进 DNA 链的连接。 它在活生物体中修复双链 DNA 中的单链断裂中发挥作用，但一些形式（如 DNA 连接酶 IV）可能专门修复双链断裂（即 DNA 的两个互补链中的断裂）。 单链断裂通过 DNA 连接酶使用双螺旋的互补链作为模板进行修复，DNA 连接酶创建最终的磷酸二酯键以完全修复 DNA。
DNA 连接酶在 DNA 修复和 DNA 复制中都有应用。 此外，DNA 连接酶在分子生物学实验室中广泛用于重组 DNA 实验。
DNA 连接酶的机制是形成两个共价磷酸二酯键，一个核苷酸（“受体”）的 3' 羟基末端与另一个核苷酸（“供体”）的 5' 磷酸末端连接。 ATP 是连接酶反应所必需的，该反应分三个步骤进行
- 酶活性中心的赖氨酸残基的腺苷酸化（添加 AMP），释放焦磷酸；
- 将 AMP 转移到所谓供体的 5' 磷酸上，形成焦磷酸键；
- 供体 5' 磷酸与受体 3' 羟基之间形成磷酸二酯键。
虽然连接酶也能处理平末端，但这需要更高的酶浓度和不同的反应条件。
大肠杆菌 DNA 连接酶由lig基因编码。大肠杆菌以及大多数原核生物中的 DNA 连接酶利用裂解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 获得的能量来形成磷酸二酯键。它不会连接平末端的 DNA，除非在聚乙二醇的分子拥挤条件下，并且不能有效地将 RNA 连接到 DNA。
来自噬菌体 T4 的 DNA 连接酶是实验室研究中最常用的连接酶。它可以连接 DNA 的粘性末端或“粘性”末端、寡核苷酸以及 RNA 和 RNA-DNA 杂交体，但不能连接单链核酸。它还可以以比大肠杆菌 DNA 连接酶高得多的效率连接平末端的 DNA。与大肠杆菌 DNA 连接酶不同，T4 DNA 连接酶不能利用 NAD，并且它对 ATP 作为辅因子有绝对的需要。一些工程学已经完成，以改善 T4 DNA 连接酶的体内活性；例如，一种成功的方法测试了与几种替代 DNA 结合蛋白融合的 T4 DNA 连接酶，发现具有 p50 或 NF-kB 作为融合伴侣的构建体在用于克隆目的的平末端连接中的活性比野生型 T4 DNA 连接酶高出 160% 以上。
磷酸酶是一种酶，通过水解磷酸单酯将磷酸基团从其底物上移除，生成磷酸根离子并带有一个游离羟基的分子（去磷酸化）。这种作用与磷酸化酶和激酶的作用完全相反，磷酸化酶和激酶利用像 ATP 这样的高能分子将其底物连接到磷酸基团。许多生物体中常见的磷酸酶是碱性磷酸酶。另一大类存在于古细菌、细菌和真核生物中的蛋白质表现出脱氧核苷酸和核苷酸磷酸酶或焦磷酸酶活性，这些活性催化 dNTP/NTP 分解成 dNDP/NDP 和一个游离磷酸根离子或 dNMP/NMP 和一个游离焦磷酸根离子。
半胱氨酸依赖性磷酸酶 (CDP) 通过磷酸半胱氨酸中间体催化磷酸酯键的水解。
游离半胱氨酸亲核试剂与磷酸部分的磷原子形成键，连接磷酸基团与酪氨酸的 P-O 键被质子化，要么通过一个适当位置的酸性氨基酸残基（下图中的 Asp）或一个水分子。然后磷酸半胱氨酸中间体被另一个水分子水解，从而为另一个去磷酸化反应再生活性位点。
金属磷酸酶（例如 PP2C）在其活性位点内协调两个催化必需的金属离子。目前，这些金属离子的身份存在一些混乱，因为连续尝试识别它们产生了不同的答案。目前有证据表明这些金属可能是镁、锰、铁、锌或它们的任何组合。人们认为一个连接两个金属离子的羟基离子参与了对磷离子的亲核攻击。
碱性磷酸酶 (EC 3.1.3.1) 可以去除许多类型分子的磷酸基团，包括核苷酸、蛋白质和生物碱。顾名思义，碱性磷酸酶在碱性环境中最有效。
实验室中碱性磷酸酶的典型用途包括去除磷酸单酯以防止自连接。
研究中常用的碱性磷酸酶包括
- 虾碱性磷酸酶 (SAP)，来自一种北极虾 (Pandalus borealis)。这种磷酸酶很容易被热量灭活，这在某些应用中是一个有用的特性。
- 小牛肠碱性磷酸酶 (CIP)
- 胎盘碱性磷酸酶 (PLAP) 及其 C 端截短版本，缺少最后 24 个氨基酸（构成针对 GPI 膜锚定的结构域） - 分泌型碱性磷酸酶 (SEAP)
碱性磷酸酶已成为分子生物学实验室的有用工具，因为 DNA 通常在其 5' 端具有磷酸基团。去除这些磷酸基团可以防止 DNA 连接（5' 端连接到 3' 端），从而使 DNA 分子保持线性，直到准备它们用于下一步骤；此外，去除磷酸基团允许放射性标记（用放射性磷酸基团替换），以便通过过程或实验的后续步骤来测量标记 DNA 的存在。出于这些目的，来自虾的碱性磷酸酶是最有用的，因为它在完成工作后最容易灭活。
碱性磷酸酶的另一个重要用途是作为酶联免疫测定的标记。
未分化的多能干细胞在其细胞膜上具有较高水平的碱性磷酸酶，因此碱性磷酸酶染色用于检测这些细胞并测试多能性（即，胚胎干细胞或胚胎癌细胞）。
外切核酸酶 III (ExoIII) 催化双链 DNA 3´-羟基末端单核苷酸的逐步去除。在每个结合事件期间去除的核苷酸数量有限，导致 DNA 分子群体中协调的渐进性缺失。优选的底物是平端或凹陷的 3´-末端，虽然 ExoIII 也作用于双链 DNA 中的切口以产生单链缺口。该酶在单链 DNA 上没有活性，因此 3´-突出末端对切割有抵抗力。抵抗程度取决于延伸的长度，4 个碱基或更长的延伸基本上对切割有抵抗力。该特性用于从具有一个耐受性（3´-悬垂）和一个敏感性（平端或 5´-悬垂）末端的线性分子中产生单向缺失。
核酸酶 S1 是一种源自米曲霉的内切核酸酶，它将单链 DNA 和 RNA 分解成寡核苷酸或单核苷酸。核酸酶 S1 用于从 DNA 分子中去除单链尾部以创建平末端，用于打开在合成双链 cDNA 过程中生成的头发夹环，并作为核酸酶保护测定中的试剂。
Taq 聚合酶是一种耐热 DNA 聚合酶，它于 1965 年从嗜热细菌温泉热菌中分离出来。
温泉热菌是一种生活在温泉和热液喷口中的细菌，Taq 聚合酶被鉴定为一种能够耐受 PCR 过程中所需的蛋白质变性条件（高温）的酶。因此，它取代了最初用于 PCR 的大肠杆菌DNA 聚合酶。Taq 的最佳活性温度为 75–80 °C，在 92.5 °C 下的半衰期大于 2 小时，在 95 °C 下的半衰期为 40 分钟，在 97.5 °C 下的半衰期为 9 分钟，并且可以在 72 °C 下在不到 10 秒的时间内复制 1000 个碱基对的 DNA 链。
Taq 聚合酶缺乏 3' 到 5' 外切核酸酶校对活性，导致复制保真度相对较低。最初，它的错误率被测量为大约 1/9,000 个核苷酸。Taq 具有末端转移酶活性，这意味着它在 3' 端添加腺嘌呤悬垂。
Pfu DNA 聚合酶是从超嗜热古细菌Pyrococcus furiosus中分离出来的。与Taq DNA 聚合酶相比，它具有更高的热稳定性和校对能力。与Taq DNA 聚合酶不同，Pfu DNA 聚合酶具有 3' 到 5' 核酸外切酶校对活性，这意味着它沿着 DNA 从 5' 端到 3' 端进行工作，并纠正核苷酸掺入错误。这意味着Pfu DNA 聚合酶生成的 PCR 片段将比Taq 生成的 PCR 插入片段具有更少的错误。然而，Pfu 速度较慢，通常需要每循环 1-2 分钟才能在 72 °C 下扩增 1 kb 的 DNA。在 PCR 反应中使用Pfu DNA 聚合酶会导致产生平端 PCR 产物。