免疫测定

蛋白质印迹法

蛋白质印迹法（有时称为蛋白质免疫印迹）是一种广泛使用的分析技术，用于检测样本中的特定蛋白质。它使用凝胶电泳以三维结构分离天然蛋白质或以多肽长度分离变性蛋白质。然后将蛋白质转移到膜（通常是硝酸纤维素或PVDF），并在那里用针对目标蛋白质的特异性抗体进行染色。凝胶电泳步骤包含在蛋白质印迹分析中，以解决抗体交叉反应的问题。许多搜索引擎（如CiteAb）可以帮助研究人员找到适合用于蛋白质印迹的抗体。

蛋白质印迹法这个名字是对Southern印迹法的戏称，Southern印迹法是一种更早由Edwin Southern 开发的用于检测DNA的技术。RNA的检测被称为Northern印迹法。

程序

电泳

错误：未找到引用错误：未找到引用样本中的蛋白质使用凝胶电泳分离。蛋白质的分离可以是通过等电点（pI）、分子量、电荷或这些因素的组合。SDS-PAGE 是迄今为止最常见的凝胶电泳类型。也可以使用二维凝胶电泳。

转移

为了使蛋白质能够被抗体检测到，它们需要从凝胶中转移到由硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯（PVDF）制成的膜上。转移蛋白质的主要方法称为电印迹，它使用电流将蛋白质从凝胶中拉到膜上。一种较旧的转移方法涉及将膜放在凝胶顶部，然后在膜顶部放置一堆滤纸。将整个叠层放入缓冲溶液中，缓冲溶液通过毛细管作用向上移动纸张，将蛋白质带到一起。在实践中，这种方法不再使用，因为它太耗时。由于任何一种印迹过程，蛋白质都会暴露在薄的表面层上，以便进行检测（见下文）。两种膜都被选择用于它们的非特异性蛋白质结合特性（即平等地结合所有蛋白质）。蛋白质结合基于疏水相互作用，以及膜和蛋白质之间的带电相互作用。硝酸纤维素膜比PVDF膜便宜，但更脆弱，不能很好地耐受重复探测。

可以使用考马斯亮蓝或丽春红S染料对膜进行染色，检查蛋白质从凝胶转移到膜的均匀性和总体有效性。丽春红S更常见，因为它具有更高的灵敏度和水溶性，后者使其更容易随后脱色和探测膜，如下所述。

封闭

由于膜被选择用于其结合蛋白质的能力，因此必须采取措施来防止膜与用于检测目标蛋白质的抗体之间的相互作用。非特异性结合的封闭是通过将膜放置在稀释的蛋白质溶液中实现的——通常是3-5%的牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉（两者都不贵）在Tris缓冲盐水（TBS）或I-Block中，并含有微量的（0.1%）洗涤剂，如吐温20或Triton X-100。稀释溶液中的蛋白质会附着在膜上，所有目标蛋白质未附着的地方。因此，当添加抗体时，膜上没有空间让它附着，除了在特定目标蛋白质的结合位点。这降低了蛋白质印迹法最终产物中的“噪音”，从而获得更清晰的结果，并消除了假阳性。

检测

在检测过程中，用连接到报告酶的修饰抗体“探测”膜上的目标蛋白。当暴露于合适的底物时，这种酶会驱动显色反应并产生颜色。由于多种原因，这传统上是在两步过程中进行的，尽管现在有一些一步检测方法可用于某些应用。

在两步过程中，将稀释的一抗溶液（通常在0.5到5微克/毫升之间）在轻微搅拌下与膜一起孵育。通常，溶液由缓冲盐溶液组成，其中包含少量的洗涤剂，有时还包含奶粉或BSA。抗体溶液和膜可以密封在一起孵育，从30分钟到过夜不等。它也可以在不同的温度下孵育，更高的温度与更多的结合相关，既有特异性结合（到目标蛋白质，即“信号”），也有非特异性结合（“噪音”）。

在冲洗膜以去除未结合的一抗后，将膜暴露于另一种抗体中，该抗体针对一抗的物种特异性部分。抗体来自动物来源（或动物来源的杂交瘤培养物）。抗小鼠二抗几乎可以结合任何小鼠来源的一抗，这使得整个实验室能够共享单一来源的大量生产的抗体，从而节省了一些成本，并提供了更加一致的结果。二抗通常与生物素或报告酶（如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶）相连。这意味着多个二抗会结合到一个一抗上，从而增强信号。

最常见的是使用辣根过氧化物酶连接的二抗来裂解化学发光剂，反应产物产生的化学发光强度与蛋白质的量成正比。将一张灵敏的照相胶片放在膜上，暴露于反应产生的光会生成与与印迹结合的抗体相对应的图像。一种更便宜但灵敏度较低的方法是使用1%过氧化氢的4-氯萘酚染色；过氧化物自由基与4-氯萘酚的反应产生深紫色染色，可以在不使用专用照相胶片的情况下进行拍照。

另一种二抗检测方法利用近红外（NIR）荧光团连接的抗体。从荧光染料激发产生的光是静态的，这使得荧光检测成为对标记抗体与蛋白质印迹中蛋白质结合产生的信号差异的更精确和准确的测量。蛋白质可以被准确地定量，因为从膜上的不同量蛋白质产生的信号是在静态状态下测量的，而化学发光是在动态状态下测量光的。

第三种替代方法是使用放射性标记而不是连接到二抗的酶，例如用放射性碘同位素标记抗体结合蛋白（如金黄色葡萄球菌蛋白A或链霉亲和素）。由于其他方法更安全、更快、更便宜，因此这种方法现在很少使用；然而，这种方法的一个优点是基于自显影的成像的灵敏度，当与光学软件（例如Optiquant）结合使用时，它能够进行非常精确的蛋白质定量。

由于在不同的过程中生产初级和二级抗体比较容易，因此探测过程在历史上分两步进行。这在灵活性方面为研究人员和公司带来了巨大的优势，并在检测过程中增加了放大步骤。然而，随着高通量蛋白质分析和更低检测限的出现，人们对开发一步探测系统产生了兴趣，这种系统可以使该过程更快、消耗更少的试剂。这需要一种探测抗体，既能识别目标蛋白质，又能包含可检测的标记，这些探测抗体通常可用于已知的蛋白质标签。将初级探测抗体与膜一起孵育，其方式类似于两步法中的初级抗体，然后在经过一系列洗涤步骤后即可进行直接检测。

分析

在洗去未结合的探测抗体后，Western Blot 就可以检测到标记并与目标蛋白质结合的探测抗体。在实践中，并非所有的 Western Blot 都会在膜上只显示一个条带的蛋白质。通过将染色条带与电泳过程中加载的标记或阶梯进行比较，可以得到大小的近似值。该过程通常会针对结构蛋白重复进行，例如肌动蛋白或微管蛋白，这些蛋白在样本之间不应该发生变化。通过将目标蛋白质的量标准化为结构蛋白，可以对组间进行控制。更优的策略是将总蛋白质标准化为用三氯乙醇或赤霉素处理后的总蛋白质。这种做法确保在出现错误或转印不完全的情况下，对膜上的总蛋白质含量进行校正。

比色法检测方法依赖于将 Western Blot 与底物一起孵育，该底物会与结合到二级抗体上的报告酶（例如过氧化物酶）反应。这会将可溶性染料转化为不同颜色的不溶性形式，该形式会沉淀在酶旁边，从而使膜染色。然后通过洗去可溶性染料来停止印迹的显影。通过密度测定（染色的强度）或分光光度法来评估蛋白质水平。

化学发光检测方法依赖于将 Western Blot 与底物一起孵育，该底物在暴露于二级抗体上的报告物时会发光。然后，CCD 相机检测到光，捕捉到 Western Blot 的数字图像或胶片图像。胶片在 Western Blot 检测中的使用正在慢慢消失，因为图像的非线性（非准确量化）。通过密度测定法分析图像，该方法评估蛋白质染色的相对量，并将结果量化为光密度。如果使用合适的标准，更新的软件可以进行进一步的数据分析，例如分子量分析。

放射性标记不需要酶底物，而是允许将医用 X 射线胶片直接放置在 Western Blot 上，该胶片会在暴露于标记时显影，并产生与感兴趣的蛋白质条带相对应的暗区。放射性检测方法的重要性正在下降，因为它存在危险的辐射，成本很高，健康和安全风险很高，而 ECL（增强化学发光）提供了一个有用的替代方案。

荧光标记探针被光激发，然后通过光电传感器（例如配备有适当发射滤光片的 CCD 相机）检测激发的发射，该相机捕捉到 Western Blot 的数字图像，并允许进行进一步的数据分析，例如分子量分析和定量 Western Blot 分析。荧光被认为是定量最好的方法之一，但灵敏度低于化学发光。

ELISA

酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种使用抗体和颜色变化来检测物质的试验。ELISA 已被用作医学和植物病理学中的诊断工具，以及各种行业中的质量控制检查。

进行 ELISA 至少需要一种针对感兴趣物质的特异性抗体。具有未知数量这种抗原的样本被固定在固体载体上（通常是聚苯乙烯微孔板），无论是非特异性地（通过吸附到表面）还是特异性地（通过另一种针对相同抗原的抗体捕获，在“夹心”ELISA 中）。在抗原固定后，添加检测抗体，与抗原形成复合物。检测抗体可以共价连接到酶上，也可以被连接到酶的二级抗体检测。在每一步之间，通常用温和的去污剂溶液洗涤板，以去除任何非特异性结合的蛋白质或抗体。在最后一步洗涤后，通过添加酶底物显影板，以产生可见信号，表明样本中抗原的量。

使用二级抗体避免了为每种想要检测的抗原创建酶连接抗体的昂贵过程。通过使用与其他抗体的 Fc 区结合的酶连接抗体，这种相同的酶连接抗体可以在各种情况下使用。ELISA 中使用的酶包括辣根过氧化物酶 (HRP)、碱性磷酸酶 (AP) 或葡萄糖氧化酶。这些酶允许检测，因为它们在某些试剂存在下会产生可观察到的颜色变化。在某些情况下，这些酶会暴露在试剂中，使它们产生光或化学发光。使用酶是因为它们充当放大器，即使只有少量酶连接抗体仍然结合，也能产生可检测的信号。

直接 ELISA

直接 ELISA 包括以下步骤

将待测抗原的缓冲溶液添加到微孔板的每个孔中，在那里给予时间通过电荷相互作用吸附到塑料上。
在孔中加入非反应性蛋白质溶液，例如牛血清白蛋白或酪蛋白，以覆盖孔中未被抗原覆盖的任何塑料表面。
加入初级抗体，其特异性结合到覆盖孔的测试抗原上。这种初级抗体也可以存在于供体血清中，以测试其对抗原的反应性。
加入二级抗体，它会结合初级抗体。这种二级抗体通常附着有酶，这对抗体的结合特性影响很小。在其他情况下，如图 5 所示，初级抗体本身与酶偶联。
然后加入这种酶的底物。通常，这种底物在与酶反应后会改变颜色。颜色变化表明二级抗体已与初级抗体结合，这强烈表明供体对测试抗原产生了免疫反应。这在临床环境和研究中很有帮助。
血清中存在的初级抗体浓度越高，颜色变化越强。通常，使用光度计来给出颜色强度的定量值。

在文献中，“直接 ELISA”和“间接 ELISA”这两个名称的用法和含义因实验的背景而异。当分析抗原的存在时，“直接 ELISA”是指只使用标记的初级抗体的 ELISA，而“间接 ELISA”是指抗原与初级抗体结合，然后由标记的二级抗体检测的 ELISA。在后一种情况下，夹心 ELISA 与间接 ELISA 明显不同。当“初级”抗体是感兴趣的，例如在免疫分析的情况下，这种抗体被二级抗体直接检测，并且“直接 ELISA”适用于两个抗体的设置。

夹心 ELISA

直接 ELISA 的一个主要缺点是抗原固定方法不具有特异性；当使用血清作为测试抗原的来源时，样本中的所有蛋白质都可能粘附到微孔板孔中，因此血清中分析物的浓度很低，在与孔表面结合时必须与其他血清蛋白竞争。夹心 ELISA 通过使用针对测试抗原的捕获抗体来解决这个问题，该抗体可以将测试抗原从血清的分子混合物中拉出来。这种捕获抗体与表面的结合是夹心 ELISA 的第一步。在阻断表面上的非特异性结合位点后，加入样本，如果存在，抗原将与捕获抗体结合。以下程序与直接 ELISA 相同。

使用纯化的特异性抗体将抗原连接到塑料上，消除了在测量之前从复杂混合物中纯化抗原的需要，简化了测定方法，并提高了测定的特异性和灵敏度。

竞争性ELISA

ELISA的第三种应用是通过竞争性结合。这种ELISA的步骤与前两个例子略有不同。

将未标记的抗体添加到样品中。如果样品中含有抗原，它将被抗体结合。
然后将这些抗体/抗原复合物添加到抗原包被的孔中。
洗涤板，以去除未结合的抗体。样品中抗原越多，形成的Ag-Ab复合物就越多，因此可用于结合孔中抗原的未结合抗体就越少。
加入针对初级抗体的次级抗体。这种第二抗体与酶偶联。
加入底物，剩余的酶会产生显色或荧光信号。
停止反应，以防止最终信号饱和。

一些竞争性ELISA试剂盒包含酶联抗原，而不是酶联抗体。标记的抗原与样品抗原（未标记）竞争初级抗体结合位点。样品中抗原越少，保留在孔中的标记抗原就越多，信号就越强。

ELISPOT

酶联免疫斑点 (ELISPOT) 测定是一种广泛用于监测人类和动物细胞免疫反应的方法，并在结核病诊断以及监测移植患者的移植物耐受或排斥方面找到了临床应用。ELISPOT 技术已被证明是监测细胞介导免疫的最有效手段之一，因为它能够灵敏而准确地检测稀有抗原特异性 T 细胞（或 B 细胞），并且能够在周围血单核细胞 (PBMC) 群体中可视化单个阳性细胞。

简而言之，在适当的条件下，ELISPOT 测定允许可视化单个活化或响应细胞的分泌产物。测定中产生的每个斑点代表一个单一的反应性细胞。因此，ELISPOT 测定提供定性（关于特定的细胞因子或其他分泌的免疫分子）和定量（测试群体中响应细胞的频率）信息。

在 ELISPOT 测定中，96 孔 PVDF 膜微孔板中的膜表面涂有捕获抗体，该抗体与所测定细胞因子的特定表位结合。在细胞孵育和刺激步骤中，PBMC 与抗原一起接种到板的孔中，并在孔的膜表面形成单层。随着抗原特异性细胞被激活，它们释放细胞因子，细胞因子在有机会扩散到培养上清液中或被蛋白酶降解并被旁观细胞上的受体结合之前，直接被固定在膜表面上的抗体捕获。随后的检测步骤将固定化的细胞因子可视化为免疫斑点；本质上是活化细胞的分泌足迹。

ELISPOT 的实际检测限通常取决于在测定孔中接种的细胞数量。通常，每个孔将使用 200,000 - 400,000 个 PBMC 进行测定，但通常使用高达一百万个细胞来检测罕见事件。ELISPOT 能够检测该群体中单个抗原阳性细胞。

原理

ELISPOT 测定采用与夹心 ELISA 技术非常相似的技术。单克隆（优先选择更高的特异性）或多克隆捕获抗体无菌涂覆到 PVDF（聚偏二氟乙烯）背衬的微孔板上。板通常用血清蛋白进行封闭，该血清蛋白与测定中的任何抗体均无反应。在此之后，将感兴趣的细胞以不同的密度铺板，并添加抗原或有丝分裂原，然后置于 37°C CO2 恒温培养箱中培养指定时间。

活化细胞分泌的细胞因子（或其他感兴趣的细胞产物）被涂覆在高表面积 PVDF 膜上的抗体局部捕获。在洗涤孔以去除细胞、碎屑和培养基成分后，将针对所选分析物的生物素化多克隆抗体添加到孔中。该抗体与靶细胞因子的不同表位反应，因此被用于检测捕获的细胞因子。在洗涤以去除任何未结合的生物素化抗体后，使用与酶偶联的链霉亲和素（辣根过氧化物酶 (HRP) 或碱性磷酸酶 (AP)）和沉淀底物（例如 AEC、BCIP/NBT）将检测到的细胞因子可视化。有色终产物（一个斑点，通常是红色（对于 HRP）或蓝黑色（对于 AP））通常代表单个产生细胞因子的细胞。可以用手动计数（例如，用解剖显微镜）或使用自动读取器来捕获微孔图像并分析斑点数量和大小来计数斑点。

侧流测试

侧流测试，也称为侧流免疫层析测定，是一种简单的设备，用于检测样本中目标分析物的存在（或不存在），而无需专门的和昂贵的设备，尽管许多实验室应用存在，它们得到读取设备的支持。通常，这些测试用于医疗诊断。一种广泛传播且众所周知的应用是家庭妊娠测试。

该技术基于一系列毛细血管床，例如多孔纸或烧结聚合物。这些元素中的每一个都具有自发输送液体（例如尿液）的能力。第一个元素（样品垫）充当海绵，并容纳过量的样本液体。浸泡后，液体迁移到第二个元素（偶联垫），制造商在其中存储了所谓的偶联物，即生物活性颗粒的干燥形式，包含在盐糖基质中，其中包含保证目标分子（例如，抗原）与其化学伴侣（例如，抗体）之间发生优化化学反应所需的一切，该化学伴侣已固定在颗粒表面。当样本液体溶解盐糖基质时，它也会溶解颗粒，并且在一个组合的传输动作中，样本和偶联物混合，同时流过多孔结构。通过这种方式，分析物在迁移通过第三个毛细血管床时与颗粒结合。该材料有一个或多个区域（通常称为条带），其中已固定第三个分子。当样本偶联物混合物到达这些条带时，分析物已结合到颗粒上，并且第三个“捕获”分子结合该复合物。一段时间后，当越来越多的液体通过条带时，颗粒会积聚，并且条带区域会变色。通常，至少有两个条带：一个（对照）捕获任何颗粒，从而表明反应条件和技术工作正常，另一个包含特定的捕获分子，并且仅捕获那些已固定有分析物分子的颗粒。在通过这些反应区后，液体进入最终的多孔材料（吸液芯），该材料仅充当废物容器。侧流测试可以作为竞争性测定或夹心测定来运行。