生命科学方法与概念/核酸分离
从细菌中分离质粒 DNA 包括三个步骤
- 细菌培养的生长
- 细菌的收获和裂解
- 质粒 DNA 的纯化
含有感兴趣质粒的细菌通常在含有抗生素的培养基中过夜培养，该抗生素适合质粒。然后，对样品进行离心，以将细胞物质（包括 DNA）浓缩到容器底部形成沉淀。去除上清液，然后将沉淀物悬浮在含有 EDTA 的生理缓冲液中。EDTA 的作用是螯合二价金属阳离子，如 Mg2+ 和 Ca2+，这些阳离子是 DNA 降解酶 (DNAses) 功能所必需的，还有助于稳定 DNA 磷酸骨架。
随后，加入强碱性溶液（pH 12.0-12.5），该溶液由去垢剂十二烷基硫酸钠 (SDS) 和强碱，如氢氧化钠 (NaOH) 组成。去垢剂破坏细胞膜，碱使染色体 DNA 和质粒 DNA 变性。
最后，加入醋酸钾。这会酸化溶液，并允许质粒 DNA 复性。然而，较大且超螺旋程度较低的染色体 DNA 会与蛋白质和去垢剂一起沉淀。进行最终离心，这次沉淀物只包含碎片，可以丢弃。另一方面，含有质粒的上清液可以在后续步骤中纯化。这种裂解方法被称为碱性裂解。
核酸纯化的传统方法是苯酚-氯仿提取。简而言之，将水性样品与等体积的苯酚：氯仿混合物混合。混合后，将混合物离心，形成两个不同的相，因为苯酚：氯仿混合物与水不相混溶。水相在上层，因为它比有机相（苯酚：氯仿）密度低。蛋白质将分配到下层有机相中，而核酸（以及其他污染物，如盐、糖等）将保留在上层水相中。小心地吸取上层水相，并注意不要吸取任何有机相或界面处的物质。此过程通常执行多次，以提高 DNA 的纯度。
如果混合物呈酸性，DNA 会沉淀到有机相中，而 RNA 则保留在水相中，因为 DNA 比 RNA 更容易中和。
如今，试剂盒通常用于分离质粒 DNA。这些试剂盒的命名方式是根据细菌培养物的规模和相应的质粒产量。按顺序排列，分别是迷你制备、中制备、最大制备、超大制备和巨型制备。
迷你制备试剂盒将碱性裂解与通过硅胶基旋转柱进行的质粒纯化结合在一起。在高盐浓度下，带正电的离子可以在带负电的 DNA 和带负电的硅胶基质之间形成盐桥。小核酸（最多 70 bp）和蛋白质可以使用含有高盐浓度的乙醇溶液洗脱。之后，质粒 DNA 用水或 TE 缓冲液洗脱。