蛋白质结构测定

在蛋白质数据库中，约 90% 的蛋白质结构是通过 X射线晶体学确定的。这种方法可以测量蛋白质在结晶状态下电子的三维 (3-D) 密度分布，从而推断所有原子的 3-D 坐标，并确定到一定分辨率。约 9% 的已知蛋白质结构是通过核磁共振技术获得的。可以通过圆二色性测定二级结构组成。振动光谱也可以用来表征肽、多肽和蛋白质的构象。近年来，冷冻电镜已成为确定蛋白质结构的一种手段，分辨率高达 5 埃或 0.5 纳米，预计在未来十年中，它将作为一种高分辨率工作工具而变得更加强大。

X射线晶体学

X射线晶体学是一种用来识别晶体原子和分子结构的工具，其中晶体原子会导致入射 X射线束衍射成许多特定的方向。通过测量这些衍射光束的角度和强度，晶体学家可以产生晶体中电子密度的三维图像。从这种电子密度中，可以确定晶体中原子平均位置，以及它们的化学键、无序度和各种其他信息。

在单晶 X射线衍射测量中，将晶体安装在测角仪上。测角仪用于将晶体定位在选定的方向。用细聚焦的单色 X射线束轰击晶体，产生规律间隔的斑点，称为反射。在不同旋转角度拍摄的二维图像通过傅里叶变换的数学方法，结合样品已知的化学数据，转换成晶体中电子密度的三维模型。如果晶体太小，或者内部结构不均匀，则会导致分辨率差（模糊）甚至错误。

结晶

晶体学通常需要高度规则的纯晶体来解析复杂的原子排列结构。蛋白质晶体几乎总是生长在溶液中。最常见的方法是逐渐降低其组成分子的溶解度；如果这样做太快，分子将从溶液中析出，在容器底部形成无用的粉尘或无定形凝胶。溶液中晶体生长有两个步骤：成核形成一个微观晶体（可能只有 100 个分子），然后是生长，理想情况下会生长到一个衍射级晶体。有利于第一步（成核）的溶液条件并不总是与有利于第二步（后续生长）的溶液条件相同。晶体学家的目标是确定有利于单个大晶体形成的溶液条件，因为较大的晶体可以提供分子分辨率的提高。因此，溶液条件应不利于第一步（成核），但有利于第二步（生长），这样每个液滴中只形成一个大晶体。如果成核过于有利，液滴中将形成许多小晶体，而不是一个大晶体；如果成核不利，则根本不会形成晶体。

很难预测良好有序晶体成核或生长的良好条件。在实践中，可以通过筛选来确定有利条件；制备一大批目标分子，并测试各种结晶溶液。在找到成功的条件之前，通常要尝试数百种甚至数千种溶液条件。各种条件可以使用一种或多种物理机制来降低分子的溶解度；例如，一些条件会改变 pH 值，一些条件会包含霍夫迈斯特级数的盐或降低溶液介电常数的化学物质，还有一些条件会包含大分子聚合物（如聚乙二醇），这些聚合物通过熵效应将分子从溶液中驱除出去。也经常尝试使用几种温度来鼓励结晶，或者逐渐降低温度，使溶液过饱和。这些方法需要大量的目标分子，因为它们使用高浓度的分子来结晶。由于难以获得大量（毫克级）的结晶级蛋白质，因此开发了机器人，能够准确地分配结晶试验滴，体积约为 100 纳升。这意味着与手工设置的结晶试验（约 1 微升）相比，每次实验使用的蛋白质减少了 10 倍。

已知有几种因素会抑制或损害结晶。生长中的晶体通常保持在恒定温度下，并防止震动或振动，这些震动或振动可能会干扰它们的结晶。分子或结晶溶液中的杂质通常不利于结晶。分子中的构象柔性也会使结晶变得不太可能，这是由于熵效应。如果未能使目标分子结晶，晶体学家可能会尝试使用稍微修饰的分子版本再次进行尝试；即使分子性质发生细微变化也会导致结晶行为发生巨大差异。

数据收集

晶体被安装以便进行测量，这样它就可以被放置在 X射线束中并旋转。蛋白质晶体用一个环状物舀起，然后用液氮快速冷冻。这种冷冻减少了 X射线的辐射损伤，以及由热运动（德拜-瓦勒效应）引起的布拉格峰的噪声。然而，未经处理的蛋白质晶体在快速冷冻时通常会破裂；因此，它们通常在冷冻前先浸泡在冷冻保护剂溶液中。不幸的是，这种预浸泡本身会导致晶体破裂，使其不适合晶体学。通常，成功的低温条件是通过反复试验确定的。

毛细管或环状物安装在测角仪上，使它能够准确地定位在 X射线束中并旋转。由于晶体和光束都很小，因此必须将晶体在光束内中心对准，精度约为 25 微米，这可以通过聚焦在晶体上的相机来帮助完成。最常见的测角仪类型是“卡帕测角仪”，它提供三个旋转角度：ω 角，绕垂直于光束的轴旋转；κ 角，绕与 ω 轴成约 50° 的轴旋转；最后，φ 角绕环状物/毛细管轴旋转。在数据收集过程中进行的振荡（下面提到）只涉及 ω 轴。

然后用一束单色 X射线照射安装好的晶体。最亮、最有用 X射线源是同步辐射加速器；它们的光亮度高得多，可以实现更好的分辨率。它们也方便调节辐射波长，这在多波长反常色散相位确定（下面描述）中很有用。同步辐射加速器通常是国家级设施，每个设施都有多个专门的光束线，这些光束线全天候、一周七天不间断地收集数据。

更小的 X射线发生器通常用于实验室，在将晶体送到同步辐射加速器之前检查晶体的质量，有时也用于解决晶体结构。

X 射线通常会先经过滤波（使用 X 射线滤波器）以获得单一波长（单色化）并准直为单一方向，然后再照射到晶体上。滤波不仅简化了数据分析，而且还去除了不会提供有用信息，反而会降解晶体的辐射。

当将晶体安装并暴露于强 X 射线束中时，它会将 X 射线散射到一系列斑点或反射中，这些斑点可以在晶体后面的屏幕上观察到。用激光笔照射光盘也能看到类似的图案。这些斑点的相对强度提供了信息，可以确定晶体中分子在原子细节上的排列。这些反射的强度可以用照相底片、面积探测器或电荷耦合器件 (CCD) 图像传感器记录。小角度的峰对应于低分辨率数据，而大角度的峰对应于高分辨率数据；因此，可以从前几个图像中确定结构最终分辨率的上限。此时，可以确定衍射质量的一些指标，例如晶体的镶嵌度及其在峰宽中观察到的整体无序度。此时，也可以快速诊断出不适合解决结构的晶体的某些病理。

单个斑点图像不足以重建整个晶体；它只代表了完整傅里叶变换的一小部分。为了收集所有必要的信息，必须将晶体逐步旋转 180°，并在每一步记录图像。实际上，由于埃瓦尔德球的曲率，需要略大于 180° 来覆盖倒空间。但是，如果晶体具有更高的对称性，则可以记录更小的角度范围，例如 90° 或 45°。应至少更改一次旋转轴，以避免在接近旋转轴的倒空间中形成“盲点”。习惯上稍微摇动晶体（0.5-2°），以捕获倒空间的更广区域。

某些相位方法可能需要多个数据集。例如，MAD 相位需要至少记录三种（通常是四种，为了冗余）入射 X 射线辐射波长下的散射。单个晶体在收集一个数据集期间可能会因辐射损伤而过度降解；在这种情况下，必须对多个晶体进行数据集采集。

数据分析

晶体对称性、晶胞和图像缩放

记录的二维衍射图系列，每个对应于不同的晶体取向，被转换为晶体电子密度的三维模型。转换使用傅里叶变换的数学技术。每个斑点对应于电子密度中的不同类型的变化；晶体学家必须确定哪个变化对应于哪个斑点（索引）、不同图像中斑点的相对强度（合并和缩放）以及如何将这些变化组合起来以产生总电子密度（相位）。

数据处理从索引反射开始。这意味着识别晶胞的尺寸以及哪个图像峰对应于倒空间中的哪个位置。索引的副产品是确定晶体的对称性，即它的空间群。一些空间群可以从一开始就被排除在外。例如，在手性分子中无法观察到反射对称性；因此，在几乎总是手性的蛋白质分子中，230 个可能的空间群中只有 65 个是允许的。索引通常使用自动索引程序完成。确定对称性后，数据将被积分。这将包含数千个反射的数百个图像转换为单个文件，该文件至少包含每个反射的米勒指数记录以及每个反射的强度（在该状态下，该文件通常还包括误差估计和部分性测量（哪个部分给定反射记录在该图像上））。

完整的数据集可能包含数百个在不同晶体取向上拍摄的单独图像。第一步是合并和缩放这些不同的图像，即确定哪些峰出现在两个或多个图像中（合并）并将相对图像进行缩放，以便它们具有一致的强度比例。优化强度比例至关重要，因为峰的相对强度是确定结构的关键信息。晶体学数据收集的重复技术以及晶体材料通常的高对称性会导致衍射仪多次记录许多对称等效反射。这使得可以计算对称相关的 R 因子，这是一个基于对称等效反射的测量强度相似程度的可靠性指标，从而评估数据的质量。

初始相位

从衍射实验中收集的数据是晶格的倒空间表示。每个衍射“斑点”的位置受晶胞的大小和形状以及晶体中固有的对称性的控制。记录每个衍射“斑点”的强度，该强度与结构因子幅度的平方成正比。结构因子是一个复数，包含与波的幅度和相位相关的信息。为了获得可解释的电子密度图，必须知道幅度和相位（电子密度图允许晶体学家构建分子的起始模型）。相位无法在衍射实验中直接记录：这被称为相位问题。可以通过多种方法获得初始相位估计

从头算相位或直接方法：这通常是针对小分子（<1000 个非氢原子）的首选方法，并已成功用于解决小蛋白质的相位问题。如果数据的分辨率优于 1.4 Å，则可以使用直接方法通过利用某些反射组之间的已知相位关系来获得相位信息。
分子置换：如果知道相关的结构，则可以在分子置换中将其用作搜索模型，以确定分子在晶胞中的取向和位置。通过这种方式获得的相位可用于生成电子密度图。
反常 X 射线散射（MAD 或 SAD 相位）：X 射线波长可以扫描经过原子的吸收边，这会以已知的方式改变散射。通过在三个不同波长（远低于、远高于和位于吸收边中间）记录完整的反射集，可以求解反常衍射原子的子结构，进而求解整个分子的结构。将反常散射原子掺入蛋白质中最流行的方法是在富含硒代蛋氨酸的培养基中表达蛋白质，该培养基含有硒原子，该培养基在蛋氨酸营养缺陷型（无法合成蛋氨酸的宿主）中表达蛋白质。然后可以在吸收边附近进行 MAD 实验，这应该可以得出蛋白质中任何蛋氨酸残基的位置，从而提供初始相位。
重原子方法（多重同晶置换）：如果可以在晶体中引入电子致密的金属原子，则可以使用直接方法或帕特森空间方法来确定它们的位置并获得初始相位。可以通过将晶体浸泡在含重原子的溶液中或通过共结晶（在重原子的存在下生长晶体）来引入这些重原子。与 MAD 相位一样，散射幅度的变化可以被解释以产生相位。虽然这是最初解决蛋白质晶体结构的方法，但它在很大程度上已被使用硒代蛋氨酸的 MAD 相位所取代。

模型构建和相位精修

获得初始相位后，可以构建初始模型。此模型可用于精修相位，从而导致改进的模型，依此类推。给定一些原子位置的模型，可以精修这些位置及其各自的德拜-瓦勒因子（或B 因子，考虑原子的热运动）以拟合观察到的衍射数据，理想情况下会产生更好的相位集。然后可以将新模型拟合到新的电子密度图中，并进行进一步的精修。这将持续进行，直到衍射数据和模型之间的相关性最大化。一致性由R因子衡量，该因子定义为

R={\frac {\sum {||F_{\text{obs}}|-|F_{\text{calc}}||}}{\sum {|F_{\text{obs}}|}}}

其中F表示结构因子。类似的质量指标是Rfree，它是根据结构优化中未包含的反射子集（约10%）计算得出的。R因子都取决于数据的分辨率。经验法则是，Rfree应大致等于以埃为单位的分辨率除以10；因此，分辨率为2 Å的数据集应该产生最终的Rfree ~ 0.2。化学键特征，如立体化学、氢键以及键长和键角的分布，是模型质量的补充指标。相位偏差在迭代模型构建中是一个严重问题。省略图是用于检查此问题的一种常用技术。

可能无法观察到结晶分子中的每个原子——必须记住，得到的电子密度是晶体中所有分子的平均值。在某些情况下，这些原子存在过多的残余无序，并且由于多个构象而存在的原子的电子密度被扩散到无法在电子密度图中检测到的程度。氢等弱散射原子通常是不可见的。一个原子也可能在电子密度图中多次出现，例如，如果蛋白质侧链具有多个（< 4）允许的构象。在其他情况下，晶体学家可能会发现，为分子推断的共价结构是不正确的，或者发生了改变。例如，蛋白质可能被切割或经历了在结晶之前未检测到的翻译后修饰。

核磁共振波谱

核磁共振波谱，通常被称为核磁共振波谱，是一种利用某些原子核磁性的研究技术。它确定原子或包含它们的分子物理和化学性质。它依赖于核磁共振现象，可以提供有关分子结构、动力学、反应状态和化学环境的详细信息。分子中原子周围的分子内磁场改变了共振频率，从而可以了解分子的电子结构细节。这些性质的测量提供了一个地图，显示原子如何以化学方式连接，它们在空间中如何接近，以及它们相对于彼此的运动速度。

这些性质从根本上与更熟悉的磁共振成像 (MRI) 中使用的性质相同，但分子应用使用的是略微不同的方法，适用于从毫米（放射科医生感兴趣的尺度）到纳米（键合原子通常相隔纳米的一部分）的尺度变化，因子为一百万。这种尺度变化需要更高的检测灵敏度和长期测量的稳定性。与MRI不同的是，结构生物学研究不会直接生成图像，而是依赖复杂的计算机计算来生成三维分子模型。

目前，大多数样本是在水溶液中进行检测的，但正在开发的方法也可以用于处理固体样本。数据收集依赖于将样品放置在强大的磁体中，通过样品发送射频信号，并测量这些信号的吸收。根据蛋白质中原子的环境，单个原子的原子核将吸收不同的射频信号频率。此外，不同原子核的吸收信号可能会受到相邻原子核的扰动。此信息可用于确定原子核之间的距离。这些距离反过来可用于确定蛋白质的整体结构。

基本的核磁共振技术

当置于磁场中时，核磁共振活性核（如 1H 或 13C）会在其同位素特征频率下吸收电磁辐射。共振频率、吸收能量和信号强度与磁场强度成正比。

光谱采集

用射频脉冲激发样品后，获得核磁共振响应——自由感应衰减 (FID)。它是一个非常微弱的信号，需要灵敏的无线电接收器才能接收。进行傅里叶变换以从原始时域 FID 中提取频域光谱。来自单个 FID 的光谱具有低信噪比，但幸运的是，通过对重复采集进行平均，信噪比可以很容易地提高。良好的 1H 核磁共振光谱可以通过 16 次重复采集获得，这只需要几分钟。然而，对于比氢更重的元素，弛豫时间相当长，例如 13C 大约为 8 秒。因此，定量重元素光谱的采集可能很耗时，需要花费几十分钟到几小时。如果在弛豫完成之前过早地发送第二个激发脉冲，平均磁化矢量仍然指向非平行方向，导致脉冲的吸收和发射不理想。

化学位移

旋转的电荷会产生磁场，从而产生与自旋成正比的磁矩。在外部磁场存在的情况下，存在两种自旋状态（对于自旋为 1/2 的原子核）：一个自旋向上，一个自旋向下，其中一个与磁场对齐，另一个与磁场相反。两种自旋状态之间的能量差 (ΔE) 随着场强度的增加而增加，但这种差异通常非常小，导致需要强核磁共振磁体（现代核磁共振仪器为 1-20 T）。用对应于特定原子核组的精确自旋状态分离的能量照射样品，会导致处于较低能态的该组原子核被激发到较高能态。

对于自旋为 1/2 的原子核，在给定磁场强度下，两种自旋状态之间的能量差与其磁矩成正比。然而，即使所有质子具有相同的磁矩，它们也不会在相同的频率值处给出共振信号。这种差异源于感兴趣的原子核的不同电子环境。在施加外部磁场后，这些电子会响应磁场而移动，并产生局部磁场，该磁场会抵消更强的施加磁场。因此，该局部场“屏蔽”质子免受施加磁场的影響，因此必须增加施加磁场才能达到共振（吸收射频能量）。这些增量非常小，通常以百万分率 (ppm) 表示。例如，醛的质子峰与烃峰相比偏移了约 10 ppm，因为作为吸电子基团，羰基通过降低局部电子密度而屏蔽质子。

鉴于不同核磁共振信号的位置取决于外部磁场强度和参考频率，因此这些信号通常相对于参考信号（通常是 TMS（四甲基硅烷））进行报告。此外，由于核磁共振信号的分布与场有关，因此这些频率除以光谱仪频率。但是，由于我们用 MHz 除以 Hz，得到的结果会太小，因此乘以一百万。因此，此操作给出了一个称为化学位移的定位数，其单位为百万分率。为了检测如此微小的频率差异，施加的磁场必须在整个样品体积内保持恒定。高分辨率核磁共振光谱仪使用梯度线圈来调整磁场均匀性，使其达到十亿分率 (ppb)，在几立方厘米的体积内。一般来说，质子的化学位移是高度可预测的，因为位移主要由更简单的屏蔽效应（电子密度）决定，但许多重原子核的化学位移受其他因素的影响更大，包括激发态（“顺磁性”对屏蔽张量的贡献）。

化学位移提供了有关分子结构的信息。将原始数据转换为该信息的处理过程称为谱图归属。例如，对于乙醇 (CH3CH2OH) 的 1H-NMR 谱图，人们会期望在三个特定的化学位移处出现信号：一个对应于 CH3 基团，一个对应于 CH2 基团，还有一个对应于 OH 基团。一个典型的 CH3 基团的位移约为 1 ppm，与 OH 相连的 CH2 的位移约为 4 ppm，而 OH 的位移则在 2–6 ppm 之间，具体取决于所用溶剂和氢键的程度。虽然 O 原子确实通过它们共同的 sigma 键从相连的 H 上拉走了电子密度，但 O 上的电子孤对则对 H 产生屏蔽效应。由于室温下的分子运动，三个甲基质子在 NMR 实验（通常需要几毫秒）中平均化。这些质子变得简并，并在相同的化学位移处形成一个峰。

峰的形状和面积也是化学结构的指示器。在上面的例子中——乙醇的质子谱——CH3 峰的面积是 OH 峰的三倍。同样，CH2 峰的面积将是 OH 峰的两倍，但仅为 CH3 峰的 2/3。

软件允许分析峰的信号强度，在最佳弛豫条件下，与该类型质子的数量相关。分析人员必须积分峰值，而不是测量其高度，因为峰值也具有宽度——因此其大小取决于其面积，而不是其高度。然而，应该指出的是，质子或任何其他观察到的核的数量仅与最简单的单维 NMR 实验中的 NMR 信号的强度或积分成正比。在更复杂的实验中，例如，通常用于获得碳-13 NMR 谱图的实验中，信号的积分取决于核的弛豫速率及其标量和偶极耦合常数。这些因素往往是未知的 - 因此，在更复杂的 NMR 实验中很难解释 NMR 信号的积分。

J 耦合

在一维 NMR 谱图中，用于结构测定的最有用信息来自于 NMR 活性核之间的J 耦合或标量耦合（自旋-自旋耦合的一种特殊情况）。这种耦合源于不同自旋态通过分子化学键的相互作用，导致 NMR 信号分裂。这些分裂模式可能很复杂，也可能很简单，同样，也可能易于理解或具有欺骗性。这种耦合提供了关于分子中原子连接的详细见解。

耦合到n个等效（自旋 ½）核将信号分裂成一个n+1个多重峰，其强度比遵循帕斯卡三角形。耦合到额外的自旋将导致多重峰的每个组分进一步分裂，例如耦合到两个具有明显不同耦合常数的不同自旋 ½ 核将导致一个双重峰（缩写：dd）。请注意，化学等效（即具有相同的化学位移）的核之间的耦合对 NMR 谱图没有影响，而遥远核之间的耦合（通常对于柔性分子中的质子而言，超过 3 个键）通常太小而无法引起可观察到的分裂。长程耦合通常可以在环状和芳香族化合物中观察到，超过三个键，导致更复杂的裂分模式。

例如，在上面描述的乙醇的质子谱中，CH3 基团被两个相邻的 CH2 质子分裂成一个三重峰，强度比为 1:2:1。类似地，CH2 被三个相邻的 CH3 质子分裂成一个四重峰，强度比为 1:3:3:1。原则上，两个 CH2 质子也会被羟基质子再次分裂成一个双重峰，形成一个四重峰的双重峰，但酸性羟基质子的分子间交换通常会导致耦合信息的丢失。

耦合到任何自旋 ½ 核，如磷-31 或氟-19，都是以这种方式进行的（尽管耦合常数的大小可能非常不同）。但自旋大于 ½ 的核的分裂模式不同于上面描述的模式，因为自旋量子数具有两个以上的可能值。例如，耦合到氘（一个自旋为 1 的核）将信号分裂成一个1:1:1 三重峰，因为自旋 1 有三个自旋态。类似地，一个自旋 3/2 核将一个信号分裂成一个1:1:1:1 四重峰，等等。

耦合结合化学位移（以及质子的积分）不仅告诉我们关于核的化学环境的信息，还告诉我们关于分子内相邻 NMR 活性核的数量的信息。在更复杂的谱图中，具有类似化学位移的多个峰，或在氢以外的核的谱图中，耦合通常是区分不同核的唯一方法。

二维 NMR 光谱学

二维 NMR 是一组 NMR 方法，它提供的数据绘制在一个由两个频率轴而不是一个频率轴定义的空间中。二维 NMR 谱图提供的信息比一维 NMR 谱图更多，特别适用于确定分子的结构，特别是对于使用一维 NMR 难以处理的复杂分子。

每个实验都包含一系列射频 (RF) 脉冲，它们之间有延迟时间。正是这些脉冲的定时、频率和强度将不同的 NMR 实验彼此区分开来。几乎所有的二维实验都有四个阶段：准备阶段，通过一组 RF 脉冲产生磁化相干性；演化阶段，一个确定的时间长度，在此期间不提供脉冲，核自旋被允许自由进动（旋转）；混合阶段，通过另一组脉冲将相干性操作到一种状态，该状态将产生可观察到的信号；以及检测阶段，在该阶段，观察到样品的自由感应衰减信号随时间的函数。

二维 NMR 实验的两个维度是代表化学位移的两个频率轴。每个频率轴都与两个时间变量中的一个相关联，这两个时间变量分别是演化周期的长度（演化时间）和检测周期内经过的时间（检测时间）。它们都是通过二维傅里叶变换从时间序列转换为频率序列。单个二维实验是作为一系列一维实验生成的，在连续的实验中具有不同的特定演化时间，并且在每个实验中记录检测周期的整个持续时间。

最终结果是一个图，显示每个频率变量对的强度值。谱图中峰的强度可以使用第三维度表示。更常见的是，强度用等高线或不同的颜色表示。

同核通过键相关方法

在这些方法中，磁化传递发生在相同类型的核之间，通过连接最多几个键的核的 J 耦合。

在标准 COSY 中，准备（p1）和混合（p2）阶段分别包含一个单一的 90° 脉冲，它们之间隔着演化时间 t1，并且在检测阶段，在各种时间 t2 上读取样品的共振信号。

第一个也是最流行的二维 NMR 实验是同核相关光谱 (COSY) 序列，它用于识别彼此耦合的自旋。

COSY 实验产生的二维谱图显示了单个同位素的频率，最常见的是氢 (1H)，沿着两个轴。COSY 谱图显示两种类型的峰。对角峰在每个轴上具有相同的频率坐标，并沿图的对角线出现，而交叉峰在每个频率坐标上具有不同的值，并偏离对角线出现。对角峰对应于一维 NMR 实验中的峰，而交叉峰表示成对核之间的耦合（就像多重峰分裂在一维 NMR 中表示耦合一样）。

全相关光谱 (TOCSY) 类似于 COSY，因为观察到耦合质子的交叉峰。但是，不仅观察到直接耦合的核之间的交叉峰，而且观察到通过耦合链连接的核之间的交叉峰。这使得它有助于识别更大的相互连接的自旋耦合网络。这种能力是通过插入一系列重复的脉冲来实现的，这些脉冲在混合阶段引起各向同性混合。更长的各向同性混合时间会导致极化通过越来越多的键传播开来。

异核通过键相关方法

异核相关光谱根据两个不同类型的核之间的耦合给出信号。通常，这两个核是质子和另一个核（称为“异核”）。

蛋白 NleG3-2 片段的 ¹H–¹⁵N HSQC 谱图。谱图中的每个峰代表一个成键的 N-H 对，其两个坐标对应于 H 和 N 原子的每个原子的化学位移。一些峰用给出该信号的氨基酸残基标记。

异核单量子相关光谱 (HSQC) 检测两个不同类型的核之间的相关性，它们被一个键隔开。该方法为每一对耦合核提供一个峰，其两个坐标是两个耦合原子的化学位移。

HSQC 通过使用 INEPT 脉冲序列将磁化从S（敏感）核（通常是质子）转移到I（不敏感）核（通常是杂原子）来工作；第一步是完成的，因为质子具有更大的平衡磁化，因此此步骤产生更强的信号。然后磁化演化，然后转移回S核以进行观察。然后可以可选地使用额外的自旋回波步骤来解耦信号，通过将多重峰折叠成单个峰来简化谱图。通过使用一个特定脉冲的相位反转两次运行实验来消除不需要的未解耦信号；这反转了所需峰的符号，而不是不需要的峰的符号，因此减去两个谱图将只给出所需峰。

15N HSQC 实验是蛋白质 NMR 中最常记录的实验之一。除了脯氨酸以外，蛋白质的每个残基都有一个连接到肽键中的氮的酰胺质子。HSQC 提供了氮和酰胺质子之间的相关性，每个酰胺在 HSQC 谱图中产生一个峰。

通过空间相关方法

这些方法建立了原子核之间的相关性，这些原子核在空间上彼此靠近，无论它们之间是否存在化学键。它们利用核Overhauser效应（NOE），即附近的原子（约5埃以内）通过与自旋-晶格弛豫相关的机制发生交叉弛豫。

在 **核Overhauser效应谱（NOESY）** 中，混合期间核自旋之间的核Overhauser交叉弛豫被用来建立相关性。所获得的光谱类似于COSY，具有对角线峰和交叉峰，但是交叉峰连接来自空间上靠近的原子核的共振，而不是那些通过键耦合的原子核。NOESY光谱还包含额外的 *轴向峰*，这些峰不会提供额外的信息，可以通过反转第一个脉冲的相位来消除。

NOESY的一个应用是研究大型生物分子，如蛋白质核磁共振，它通常可以通过顺序行走来分配。

步骤

蛋白质核磁共振是在高度纯化的蛋白质水溶液中进行的。与X射线晶体学不同，核磁共振谱通常仅限于小于35 kDa的蛋白质，虽然更大的结构已被解决。核磁共振谱通常是获得部分或完全内在无结构蛋白质的高分辨率信息的唯一方法。为了便于实验，希望用13C和15N同位素标记蛋白质，因为主要的天然同位素12C不是核磁共振活性的，而主要的天然同位素14N的核四极矩阻止了从该氮同位素获得高分辨率信息。

为了分析核磁共振数据，重要的是获得蛋白质的共振分配，即找出哪个化学位移对应于哪个原子。这通常通过使用从几种不同类型的NMR实验中获得的信息进行顺序行走来实现。具体步骤取决于蛋白质是否被同位素标记，因为许多分配实验依赖于碳-13和氮-15。

为了进行结构计算，需要生成许多实验确定的约束条件。这些约束条件分为不同的类别，其中最广泛使用的是距离约束和角度约束。例如，NOESY实验中的交叉峰表示两个原子核在空间上的接近。因此，每个峰可以转换为两个原子核之间的最大距离，通常在1.8到6埃之间。NOESY峰的强度与距离的负6次方成正比，因此距离是根据峰的强度来确定的。强度-距离关系并不精确，因此通常使用距离范围。

实验确定的约束条件可以用作结构计算过程的输入。研究人员试图满足尽可能多的约束条件，以及蛋白质的一般性质，如键长和键角。该算法将约束条件和蛋白质的一般性质转换为能量项，并试图最小化能量。该过程会生成一系列结构，如果数据足以确定一个特定的折叠，这些结构将收敛。