生命科学方法与概念/光谱学
光谱学是研究物质与电磁辐射相互作用的学科。从历史上看，光谱学起源于对可见光根据其波长通过棱镜分散的研究。后来，这一概念得到了极大的扩展，包括了任何与辐射能量作为其波长或频率的函数的相互作用。
吸收光谱指的是测量由于与样品相互作用而导致的辐射吸收作为频率或波长的函数的光谱技术。样品吸收能量，即光子，来自辐射场。吸收强度随频率而变化，这种变化就是吸收光谱。
吸收光谱被用作一种工具来确定样品中特定物质的存在，并且在许多情况下，来量化样品中存在物质的量。红外和紫外-可见光谱在分析应用中尤其常见。吸收光谱也被用于分子和原子物理学、天体光谱学和遥感的研究中。
有各种各样的实验方法来测量吸收光谱。最常见的排列是将生成的辐射束指向样品，并检测穿过样品的辐射强度。透射能量可用于计算吸收。光源、样品排列和检测技术根据频率范围和实验目的而有很大差异。
吸收线通常根据在分子或原子中诱导的量子力学变化的性质进行分类。例如，旋转线发生在分子旋转状态发生变化时。旋转线通常在微波光谱区域中找到。振动线对应于分子振动状态的变化，并且通常在红外区域中找到。电子线对应于原子或分子的电子状态的变化，并且通常在可见光和紫外区域中找到。X射线吸收与原子内层电子的激发有关。这些变化也可以组合（例如旋转-振动跃迁），导致新的吸收线出现在两种变化的组合能量处。
与量子力学变化相关的能量主要决定了吸收线的频率，但频率可以被几种类型的相互作用所改变。电场和磁场会导致偏移。与相邻分子的相互作用会导致偏移。例如，当气相分子处于液相或固相中并与相邻分子更强烈地相互作用时，气相分子的吸收线会发生明显偏移。
比尔-朗伯定律将光的衰减与光穿过的物质的性质联系起来。
当光穿过样品时，其强度会下降。这种下降与物质的浓度c、强度I和一个称为ε'的常数成正比。
这等于
并且可以积分
路径长度 x-x0 通常称为d。该方程可以转换为指数函数，该函数描述了光穿过样品时强度下降的情况。
在先前方程中将自然对数改为常用对数将得到比尔-朗伯定律的常见形式。
其中 ε 是摩尔衰减系数。该系数衡量的是特定化学物质在给定波长下吸收光的强弱。ε 的 SI 单位为 m2/mol，但在实际应用中，通常以 M−1 cm−1 或 L mol−1 cm−1 计量。在较早的文献中，有时会使用 cm2 mol−1，对应的数值会大 1000 倍。
在生物化学中，蛋白质在 280 nm 处的消光系数几乎完全取决于芳香残基的数量，特别是色氨酸，并且可以通过氨基酸序列预测。如果已知消光系数，则可以用来确定溶液中蛋白质的浓度。当溶液中存在多种吸收物质时，总吸光度是每种物质吸光度的总和。
| 最大吸收波长 / nm | ε / M-1 cm-1 | |
|---|---|---|
| 肽键 | 190 | 7000 |
| 215 | 100 | |
| 色氨酸 | 280 | 5600 |
| 酪氨酸 | 275 | 1500 |
| 苯丙氨酸 | 250 | 220 |
| 二硫键 | 250 | 300 |
紫外可见光谱法中使用的仪器称为 UV/Vis **分光光度计**。分光光度计的基本部件包括光源、样品架、单色仪中的衍射光栅或棱镜（用于分离不同波长的光）以及检测器。辐射源通常是氘弧灯，它在紫外区域（190-400 nm）内是连续的，也可以是氙弧灯，或者更近期的发光二极管 (LED) 用于可见光波长。检测器通常是光电倍增管、光电二极管、光电二极管阵列或电荷耦合器件 (CCD)。单光电二极管检测器和光电倍增管与扫描单色仪一起使用，单色仪过滤光线，以便一次只允许单一波长的光到达检测器。扫描单色仪移动衍射光栅以“逐步”通过每个波长，以便可以测量其强度与波长的关系。固定单色仪与 CCD 和光电二极管阵列一起使用。由于这两种设备都包含多个检测器，这些检测器分组为一维或二维阵列，因此它们能够同时收集不同波长的光，这些光落在不同的像素或像素组上。
设备主要分为两类：单光束和双光束。双光束分光光度计比较两条光路径之间的光强度，一条路径包含参考样品，另一条路径包含测试样品。单光束分光光度计测量插入测试样品前后光束的相对光强度。
用于 UV/Vis 分光光度计的样品通常是液体，尽管气体甚至固体的吸光度也可以测量。样品通常放置在一个透明的容器中，称为比色皿。比色皿通常呈矩形，通常内宽为 1 cm。（此宽度在比尔-朗伯定律中成为光程 d。）所用样品容器类型必须允许辐射通过感兴趣的光谱区域。最广泛适用的比色皿由高质量熔融石英或石英玻璃制成，因为它们在紫外、可见和近红外区域内都是透明的。玻璃和塑料比色皿也很常见，尽管玻璃和大多数塑料在紫外线下会吸收，这限制了它们在可见光波长下的使用。
以下工具可用于计算蛋白质的摩尔衰减系数
**圆二色性 (CD)** 是涉及圆偏振光的二色性，即左手和右手圆偏振光的差异吸收。左手圆偏振 (LHC) 和右手圆偏振 (RHC) 光代表光子的两种可能的自旋角动量状态。这种现象存在于旋光活性手性分子的吸收带中。CD 光谱法具有广泛的应用范围。最值得注意的是，UV CD 用于研究蛋白质的二级结构。
CD 与 **旋光色散 (ORD)** 技术密切相关，通常被认为更先进。CD是在感兴趣分子的吸收带内或附近测量的，而 ORD可以在远离这些带的地方测量。CD 的优势在数据分析中很明显。结构元素更容易区分，因为它们记录的谱带在特定波长处没有像 ORD 中那样广泛地重叠。原则上，如果测量中包含所有吸收，则可以通过积分变换将这两种光谱测量值相互转换。
电磁辐射由相互垂直且垂直于传播方向的电场 (E) 和磁场 (B) 组成，即横波。当电场矢量仅在一个平面上振荡时，就会发生线偏振光，而当电场矢量的方向在其传播方向上旋转而矢量保持恒定大小时，就会发生圆偏振光。在空间中的一个点，圆偏振矢量将在波频率的一个周期内画出一个圆，因此得名。下面的两个图表显示了线偏振光和圆偏振光的电矢量，在时间上的一个时刻，用于一系列位置；圆偏振电矢量的图绘制了沿传播方向 (k) 的螺旋线。对于向观察者传播的左旋圆偏振光 (LCP)，电矢量逆时针旋转。对于右旋圆偏振光 (RCP)，电矢量顺时针旋转。
当圆偏振光穿过吸收旋光活性介质时，右偏振光和左偏振光之间的速度不同，它们的波长也不同，它们被吸收的程度也不同（εL≠εR）。**圆二色性** 是差异 Δε ≡ εL- εR。
简而言之，由于圆偏振光本身是“手性的”，因此它与手性分子以不同的方式相互作用。也就是说，两种圆偏振光的吸收程度不同。在 CD 实验中，相同量的左旋和右旋圆偏振光以选定的波长交替照射到（手性）样品中。两种偏振光中的一种比另一种吸收更多，并测量这种与波长相关的吸收差异，从而得到样品的 CD 光谱。由于与分子的相互作用，光的电场矢量在穿过样品后会沿着椭圆路径旋转。
重要的是，分子的手性可能是构象性的，而不是结构性的。也就是说，例如，具有螺旋二级结构的蛋白质分子可以具有随构象变化而变化的 CD。
根据定义，
其中 ΔA 是左旋圆偏振光 (LCP) 和右旋圆偏振光 (RCP) 吸光度的差（通常测量的是这个）。ΔA 是波长的函数，因此对于有意义的测量，必须知道进行测量的波长。
摩尔圆二色性定义为
其中 εL 和 εR 是 LCP 和 RCP 光的摩尔消光系数。
虽然通常测量 ΔA，但出于历史原因，大多数测量结果以**椭圆度**度数报告。摩尔椭圆度是针对浓度校正的圆二色性。摩尔圆二色性和摩尔椭圆度 [θ] 通过以下方程式轻松相互转换
在圆二色性 (CD) 的许多实际应用中，测量的 CD 不仅仅是分子的内在特性，而是取决于分子构象。在这种情况下，CD 也可能是温度、浓度和化学环境（包括溶剂）的函数。在这种情况下，报告的 CD 值还必须指定这些其他相关因素，以便具有意义。
蛋白质的远紫外 (UV) 圆二色光谱可以揭示其二级结构的重要特征。圆二色光谱可以很容易地用于估计分子中处于α-螺旋构象、β-折叠构象、β-转角构象或其他（例如无规卷曲）构象的比例。这些比例分配对蛋白质可能存在的二级构象施加了重要限制。一般来说，圆二色光谱不能确定检测到的α-螺旋在分子中的位置，甚至不能完全预测α-螺旋的数量。尽管如此，圆二色光谱仍然是一个很有价值的工具，尤其是在显示构象变化方面。例如，它可以用来研究分子的二级结构如何随着温度或变性剂浓度（例如盐酸胍或尿素）的变化而变化。通过这种方式，它可以揭示关于该分子的重要热力学信息（例如变性焓和吉布斯自由能），这些信息无法通过其他方法轻易获得。任何试图研究蛋白质的人都将发现圆二色光谱是一个宝贵的工具，因为它可以在进行广泛和/或昂贵的实验之前验证蛋白质是否处于其天然构象。此外，圆二色光谱在蛋白质化学中还有许多其他用途，与α-螺旋比例估计无关。
蛋白质的近紫外圆二色光谱 (>250 nm) 提供了关于其三级结构的信息。在 250–300 nm 区域获得的信号是由于苯丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸（或 S-S 二硫键）和色氨酸氨基酸的吸收、偶极取向及其周围环境的性质。与远紫外圆二色光谱不同，近紫外圆二色光谱不能分配给任何特定的 3D 结构。相反，近紫外圆二色光谱提供了关于蛋白质中辅基性质的结构信息，例如血红蛋白和细胞色素 c 中的血红素基团。
可见光圆二色光谱是一种非常强大的技术，可以用来研究金属-蛋白质相互作用，并且可以将各个 d-d 电子跃迁解析为单独的谱带。只有当金属离子处于手性环境中时才会在可见光区域产生圆二色光谱，因此，溶液中的游离金属离子不会被检测到。这具有仅观察蛋白质结合金属的优点，因此可以轻松获得 pH 依赖性和化学计量关系。
与 X 射线晶体学和蛋白质核磁共振波谱等技术相比，圆二色光谱提供了较少的信息。X 射线晶体学和蛋白质核磁共振波谱都能提供原子分辨率的数据。然而，圆二色光谱是一种快速的方法，不需要大量的蛋白质或繁琐的数据处理。因此，圆二色光谱可以用于研究大量的溶剂条件，包括温度、pH 值、盐度以及各种辅因子的存在。
圆二色光谱通常用于研究溶液中的蛋白质，因此它补充了研究固态蛋白质的方法。这也是一个限制，因为许多蛋白质在其天然状态下嵌入膜中，并且含有膜结构的溶液通常会强烈散射光。
圆二色光谱的测量受到一个事实的复杂化，即典型的含水缓冲系统通常会在结构特征表现出对圆偏振光差吸收的范围内发生吸收。磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐和醋酸盐缓冲液通常与圆二色光谱不兼容，除非将其稀释到极低的浓度，例如 10–50 mM 范围。在进行远紫外圆二色光谱时，应完全避免使用 Tris 缓冲系统。硼酸盐和翁类化合物通常用于建立圆二色光谱实验的适当 pH 范围。一些实验人员用氟化物代替氯离子，因为氟化物在远紫外区的吸收较少，而一些实验人员则在纯水中进行实验。另一种几乎通用的技术是，在远紫外区进行实验时，使用较短光程的比色皿来最小化溶剂吸收，在本工作中，0.1 mm 光程并不罕见。
除了在含水系统中进行测量外，圆二色光谱，特别是远紫外圆二色光谱，可以在有机溶剂中进行测量，例如乙醇、甲醇或三氟乙醇 (TFE)。后者具有诱导蛋白质结构形成的优势，在一些蛋白质中诱导 β-折叠，在另一些蛋白质中诱导 α-螺旋，而这些蛋白质在正常的水性条件下不会显示出这些结构。然而，大多数常见的有机溶剂，例如乙腈、THF、氯仿、二氯甲烷，与远紫外圆二色光谱不兼容。
值得注意的是，用于二级结构估计的蛋白质圆二色光谱与连接氨基酸的酰胺键的 π 到 π* 轨道吸收有关。这些吸收带部分位于所谓的真空紫外区（波长小于约 200 nm）。由于氧气在这些波长处对光的强烈吸收，因此实际感兴趣的波长区域在空气中是无法获得的。实际上，这些光谱不是在真空中测量的，而是在一个无氧仪器（充满纯氮气）中测量的。