DNA 分子克隆/PAGE 检测
简单来说，电泳是一种根据分子大小和电荷对分子进行分类的程序。使用电场，可以使分子（如 DNA）通过由琼脂制成的凝胶移动。待分离的分子被分配到凝胶材料中的一个孔中。将凝胶置于电泳槽中，然后连接到电源。当施加电流时，较大的分子在凝胶中移动得更慢，而较小的分子移动得更快。不同大小的分子在凝胶上形成不同的条带。[需要引用] 本例中的“凝胶”是指用于包含然后分离目标分子的基质。在大多数情况下，凝胶是交联聚合物，其组成和孔隙率根据要分析的目标的特定重量和组成来选择。在分离蛋白质或小核酸（DNA、RNA 或寡核苷酸）时，凝胶通常由不同浓度的丙烯酰胺和交联剂组成，产生不同大小的聚丙烯酰胺网状结构。在分离较大的核酸（大于几百个碱基）时，首选基质是纯化的琼脂糖。在这两种情况下，凝胶形成固体但多孔的基质。丙烯酰胺不同于聚丙烯酰胺，它是一种神经毒素，必须采取适当的安全预防措施进行处理，以避免中毒。琼脂糖由长而无分支的未带电荷碳水化合物链组成，没有交联，从而导致凝胶具有大孔，允许分离大分子和大分子复合物。[需要引用] “电泳”指的是用于使分子通过凝胶基质移动的电动势 (EMF)。通过将分子置于凝胶孔中并施加电场，分子将以不同的速率通过基质移动，这在所有物种的电荷与质量比 (Z) 均匀的情况下主要由它们的质量决定，如果带负电荷则朝阳极移动，如果带正电荷则朝阴极移动。
在核酸的情况下，从负极到正极的迁移方向是由于其糖磷酸骨架自然携带的负电荷。双链 DNA 片段自然表现为长棒，因此它们在凝胶中的迁移与其大小成正比，对于环状片段，与其回转半径成正比。单链 DNA 或 RNA 往往会折叠成具有复杂形状的分子，并且根据其三级结构以复杂的方式通过凝胶迁移。因此，会使用破坏氢键的试剂（如氢氧化钠或甲酰胺）使核酸变性，使其再次表现为长棒。大型 DNA 或 RNA 的凝胶电泳通常通过琼脂糖凝胶电泳进行。请参阅“链终止法”页面以了解聚丙烯酰胺 DNA 测序凝胶的示例。可以通过迁移率转移亲和力电泳进行核酸或片段的配体相互作用表征。RNA 样品的电泳可用于检查基因组 DNA 污染以及 RNA 降解。来自真核生物的 RNA 显示出 28s 和 18s rRNA 的明显条带，其中 28s 条带的强度大约是 18s 条带的两倍。降解的 RNA 具有不太清晰的条带，具有涂抹的外观，强度比小于 2:1。
在通过电泳分离之前，可以以多种方式制备待分离的 DNA。对于大型 DNA 分子，通常使用 DNA 限制性内切酶（或称为限制性酶）将 DNA 切成更小的片段。在其他情况下，例如 PCR 扩增的样本，通过各种方法在分析之前去除样本中可能影响分子分离的酶。一旦 DNA 被正确制备，DNA 溶液的样本被放置在凝胶的孔中，并在凝胶上施加一定电压，持续特定时间。
使用特异性识别 DNA 的荧光染料（例如溴化乙锭）来可视化不同长度的 DNA 片段。凝胶显示出对应于不同分子量的不同 DNA 分子群体的条带。片段大小通常以“核苷酸”、“碱基对”或“kb”（对于数千个碱基对）表示，具体取决于分离的是单链 DNA 还是双链 DNA。片段大小测定通常通过与含有已知长度的线性 DNA 片段的市售 DNA 标记进行比较来完成。
最常用于 DNA 电泳的凝胶类型是琼脂糖（用于相对较长的 DNA 分子）和聚丙烯酰胺（用于短 DNA 分子的高分辨率，例如 DNA 测序）。凝胶传统上以“板”的形式运行，如图所示，但毛细管电泳已成为高通量 DNA 测序等应用的重要技术。用于评估 DNA 损伤的电泳技术包括碱性凝胶电泳和脉冲场凝胶电泳。测量和分析大多使用专门的凝胶分析软件进行。毛细管电泳结果通常以称为电泳图的轨迹视图显示。
溴化乙锭 (EtBr) 和其他染料对 DNA 的可视化
[edit | edit source]用于使琼脂糖凝胶电泳的 DNA 或 RNA 条带可见的最常见染料是溴化乙锭，通常缩写为 EtBr。当嵌入 DNA（或 RNA）中时，它会在紫外线下发出荧光。通过使 DNA 通过 EtBr 处理的凝胶并用紫外线观察，任何含有约 20 ng 以上 DNA 的条带都会变得清晰可见。EtBr 是一种已知的诱变剂，有更安全的替代品。即使是核酸短时间暴露于紫外线下也会对样品造成重大损害。样品的紫外线损伤会降低随后样品操作（如连接和克隆）的效率。如果 DNA 在琼脂糖凝胶分离后要使用，最好通过使用蓝色光激发源来避免暴露于紫外线下，例如 Bio-Rad 的 Xcitablue 紫外线到蓝光转换屏或 Clare Chemicals 的 Dark Reader。需要蓝色激发染料，例如 SYBR Green 或 GelGreen 染料之一。蓝光对于可视化也更好，因为它比紫外线更安全（眼睛保护不是那么关键的要求），并且可以通过透明塑料和玻璃。这意味着即使激发光通过玻璃或塑料凝胶平台，染色也会更亮。SYBR Green I 是另一种由 Invitrogen 生产的 dsDNA 染料。它更贵，但灵敏度高 25 倍，可能比 EtBr 更安全，尽管没有数据说明其对人类的诱变性或毒性。SYBR Safe 是 SYBR Green 的变体，已被证明其诱变性和毒性水平低到足以在根据美国联邦法规被视为非危险废物。它具有与 EtBr 相似的灵敏度水平，但与 SYBR Green 一样，价格要贵得多。然而，在强制性安全处置危险废物的国家，EtBr 处置成本很容易超过初始价格差异。由于 EtBr 染色的 DNA 在自然光线下不可见，因此科学家在将混合物添加到凝胶之前将 DNA 与带负电荷的加载缓冲液混合。加载缓冲液很有用，因为它们在自然光线下可见（与 EtBr 染色的 DNA 的紫外线不同），并且它们与 DNA 共沉淀（意味着它们以与特定长度的 DNA 相同的速度移动）。二甲苯氰醇和溴酚蓝是加载缓冲液中常见的染料；它们运行速度与分别为 5000 bp 和 300 bp 长度的 DNA 片段大致相同，但精确位置会随着凝胶百分比而变化。其他不太常用的进度标记是甲酚红和橙黄 G，它们分别在约 125 bp 和 50 bp 处运行。也可以通过将 DNA 转移到硝酸纤维素膜上，然后暴露于杂交探针来实现可视化。此过程称为 Southern 印迹。
电泳缓冲液
[edit | edit source]琼脂糖电泳使用多种缓冲液。最常见的是：Tris/醋酸/EDTA (TAE)、Tris/硼酸/EDTA (TBE) 和硼酸锂 (LB)。TAE 的缓冲能力最低，但对较大的 DNA 具有最佳分辨率。这意味着电压较低，时间更长，但产品更好。LB 相对较新，对于大于 5 kbp 的片段无效；但是，由于其电导率低，可以使用更高的电压（高达 35 V/cm），这意味着常规电泳的分析时间更短。在电导率极低的介质（1 mM 硼酸锂）中，3% 琼脂糖凝胶可以分辨低至 1 个碱基对的尺寸差异。
如何分析凝胶
[edit | edit source]电泳完成后，将凝胶置于紫外灯下照射（通常放在一个光盒上，同时使用防护装备来减少紫外线照射），以观察 DNA 条带。溴化乙锭在 DNA 存在的情况下会发出橙红色荧光。也可以将 DNA 条带从凝胶中切出，然后溶解以回收纯化的 DNA。凝胶可以随后用数码相机或宝丽来相机拍照。尽管染色的核酸发出橙红色荧光，但图像通常以黑白显示（见图）。
凝胶电泳研究经常利用基于软件的图像分析工具，例如 ImageJ。
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