分子克隆/PCR
PCR用于扩增DNA链的特定区域（DNA靶标）。大多数PCR方法通常扩增高达约10千碱基对（kb）的DNA片段，尽管一些技术允许扩增高达40 kb的片段。基本的PCR设置需要几种组分和试剂。这些组分包括：包含要扩增的DNA区域（靶标）的DNA模板。两个引物，分别与DNA靶标的正义链和反义链的3'（三端）末端互补。Taq聚合酶或其他在约70°C具有最佳温度的DNA聚合酶。脱氧核苷酸三磷酸（dNTP），DNA聚合酶合成新DNA链的构建块。缓冲溶液，为DNA聚合酶提供合适的化学环境，以确保最佳活性并保持稳定。二价阳离子，镁或锰离子；通常使用Mg2+，但Mn2+可用于PCR介导的DNA诱变，因为较高的Mn2+浓度会增加DNA合成过程中的错误率。一价阳离子钾离子。PCR通常在热循环仪中，于10–200 μl的反应体积内，在小反应管（0.2–0.5 ml体积）中进行。热循环仪对反应管进行加热和冷却，以在反应的每个步骤（见下文）中实现所需的温度。许多现代热循环仪利用珀耳帖效应，该效应允许通过简单地反转用于保持PCR管的块的电流来实现加热和冷却。薄壁反应管可实现良好的热传导，从而允许快速热平衡。大多数热循环仪都配备加热盖，以防止反应管顶部出现冷凝。较旧的没有加热盖的热循环仪需要在反应混合物的顶部添加一层油或在管内添加一颗蜡球。
DNA扩增的PCR按照此处描述的方法进行。模板为用于常规PCR的10 ng质粒DNA，用于基因组PCR的0.5至1 μg基因组DNA，用于RT-PCR的1 μl RT反应或用于细菌菌落PCR的细菌菌落的一部分，在一个25至50 μl的反应中。PCR在包含1X PCR缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.3，50 mM KCl，1.5 mM MgCl2，0.001% w/v明胶），250 μM的每种dNTP，250 ng的每种引物和1.5个单位的Taq DNA聚合酶的反应混合物中进行。当使用Pfu DNA聚合酶时，每个引物使用500 ng，并进行Pfu反应的热启动。然后，用矿物油覆盖样品以防止循环过程中蒸发，在94°C初始变性15分钟后进行35个循环步骤。每个循环步骤包括变性，94°C 30秒，退火（低于引物Tm 4°C）30秒或1分钟，以及延伸，72°C 1分钟。最后在72°C延伸7分钟以完成截断产物。为了通过PCR制备放射性标记探针，通过仅添加2.5 μM的每种dNTP和将引物浓度降低至100 ng的每种来确保高比活性。通常使用25 μCi（2.5 μl）的α-32P dATP进行掺入。使用50 μl的反应体积，并且循环步骤的所有其他条件与冷PCR相同。
逆向PCR与常规PCR类似，不同之处在于它使用发散引物，而不是用于常规扩增的常规汇聚引物。此外，应使用诸如pfu或pfu Turbo之类的DNA聚合酶，它们产生平端扩增产物。逆向PCR用于在任何所需的DNA片段上产生插入、缺失或点突变。多重PCR通过在同一反应混合物中混合多个不同基因的引物组来进行，并且PCR作为单个反应进行。