分子克隆/制备感受态细胞 (''E.Coli'')
根据不同克隆程序所需的转化效率，感受态细胞通过两种不同的方法制备。
将一个新鲜的 LB 琼脂平板上培养的大肠杆菌 DH5-α 单菌落接种到 5 ml LB 培养基中，并在 37 C、200 rpm 振荡培养 16 小时。将 1 ml 这种过夜培养物接种到 35 ml LB 培养基中，并在 37 C、200 rpm 振荡培养，直到 OD600 达到 0.55。然后将培养物在冰上冷却 15 分钟，并在 4 C 的 HB 4 转子中，使用 Sorvall 离心机以 1,500g 离心 15 分钟，将细胞沉淀下来。完全排出上清液，并将沉淀物轻轻重悬于 10 ml 冰冷的缓冲液 R1（100 mM RbCl、50 mM MnCl2.4H20.、30 mM 醋酸钾、10 mM CaCl2.2H20、15% 甘油）中，并在冰上孵育 20 分钟。然后将细胞分配到预冷的微量离心管中，每管 100 µl，在液氮中快速冷冻，并在 -70 C 下储存。通过这种方法制备的感受态细胞通常能产生 5 x 106 到 1 x 107 个菌落/µg pUC18 DNA 的转化效率，并且可以在 -70 C 下稳定保存 3 个月。它们被用于大多数涉及连接相容粘性末端的常规克隆实验。
缓冲液 R1
100 mM RbCl,
50 mM MnCl2.4H20.,
30 mM 醋酸钾,
10 mM CaCl2.2H20,
15% 甘油
超感受态细胞是根据此处描述的方法制备的。将一个新鲜的 LB 琼脂平板上培养的大肠杆菌 DH5 α 单菌落接种到 5 ml LB 培养基中，并在 37 C、200 rpm 振荡培养 16 小时。将 1 ml 这种过夜培养物接种到 100 ml LB 培养基中，并在 18 C、200 rpm 振荡培养，直到 OD600 达到 0.6。将培养物在冰上冷却，并在 4 C 以 1,500g 离心 15 分钟，将细胞沉淀下来。然后将细胞重悬于 32 ml 冰冷的缓冲液 I（10 mM PIPES pH 6.7、15 mM CaCl2、250 mM KCl、55 mM MnCl2）中，并在冰上孵育 10 分钟。重复离心，并将细胞重悬于 8 ml 冰冷的含有 7% DMSO 的缓冲液 I 中，分配到 100 µl 的等分试样中，在液氮中快速冷冻，并在 -70 C 下储存。通过这种方法制备的超感受态细胞能产生 1 x 108 个菌落/µg pUC18 DNA 的转化效率，并且可以在 -70 C 下稳定保存 3 个月。超感受态细胞被用于涉及连接平末端 DNA 片段的克隆实验。
缓冲液 I
10 mM PIPES pH 6.7,
15 mM CaCl2,
250 mM KCl,
55 mM MnCl2
从 -70 C 冰箱中取出感受态细胞，并在冰上解冻。将连接的 DNA 样品 (5 µl) 加入到感受态细胞中，轻轻混合。将细胞在冰上孵育 30 分钟，然后在 42 C 下进行热休克 90 秒。热休克后，向细胞中加入 400 µl LB，并将试管在 37 C 下孵育 1 小时。然后将细胞接种到含有 100 µg/ml 氨苄青霉素的 90 mm LB 琼脂平板上。在质粒载体显示出 α 互补特性的情况下，将细胞接种到含有适当抗生素的 LB 琼脂平板上，并涂覆 40 µl 的 20 mg/ml X-Gal 和 4 µl 的 200 mg/ml IPTG。将平板在 37 C 下孵育 14-16 小时，使转化子能够生长。