分子克隆/蛋白质印迹
蛋白质印迹（也称为蛋白质免疫印迹）是一种广泛使用的分析技术，用于检测给定组织匀浆或提取物样品中的特定蛋白质。
样品可以取自整个组织或细胞培养。在大多数情况下，固体组织首先使用搅拌器（对于较大的样品体积）、匀浆器（较小的体积）或超声波破碎进行机械分解。细胞也可以通过上述机械方法之一进行破裂。然而，细菌、病毒或环境样本可以是蛋白质的来源，因此蛋白质印迹不仅限于细胞研究。各种洗涤剂、盐和缓冲液可用于促进细胞裂解和溶解蛋白质。通常会添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂以防止样品被其自身酶消化。组织制备通常在低温下进行，以避免蛋白质变性和降解。多种生化和机械技术——包括各种过滤和离心——可用于分离不同的细胞区室和细胞器。
为了使蛋白质能够被抗体检测，它们从凝胶内部转移到由硝酸纤维素或聚偏氟乙烯 (PVDF) 制成的膜上。将膜放在凝胶顶部，并在其顶部放置一堆滤纸。将整个堆叠放在缓冲液中，缓冲液通过毛细管作用向上移动滤纸，将蛋白质带走。另一种转移蛋白质的方法称为电印迹，它使用电流将蛋白质从凝胶中拉到 PVDF 或硝酸纤维素膜中。蛋白质在从凝胶内部转移到膜的过程中，保持它们在凝胶内部的组织结构。由于这种“印迹”过程，蛋白质暴露在薄表面层上，以便进行检测（见下文）。两种膜都因其非特异性蛋白质结合特性而被选中（即对所有蛋白质的结合程度相同）。蛋白质结合基于疏水相互作用，以及膜和蛋白质之间的带电相互作用。硝酸纤维素膜比 PVDF 膜便宜，但要脆弱得多，而且不能很好地承受重复探测。可以用考马斯亮蓝或 Ponceau S 染料对膜进行染色，以检查蛋白质从凝胶转移到膜的均匀性和整体有效性。Ponceau S 两种染料中更常见，因为 Ponceau S 的灵敏度更高，其水溶性使其更容易像下面描述的那样随后脱色和探测膜。
在检测过程中，用一种与报告酶连接的修饰抗体对膜进行“探测”，该酶在暴露于适当底物时会驱动显色反应并产生颜色。由于各种原因，这传统上是在两步过程中进行的，尽管现在有一种步检测方法可用于某些应用。
一抗
当宿主物种或免疫细胞培养物暴露于目标蛋白质（或其一部分）时，会产生一抗。通常，这是免疫反应的一部分，而在这里，它们被收集并用作敏感且特异性的检测工具，直接与蛋白质结合。封闭后，将稀释的一抗溶液（通常在 0.5 到 5 微克/毫升之间）在轻微搅拌下与膜一起孵育。通常，溶液由含有少量洗涤剂的缓冲盐溶液组成，有时还含有奶粉或 BSA。抗体溶液和膜可以密封在一起孵育 30 分钟到过夜。它也可以在不同的温度下孵育，温度越高与结合越多相关，包括特异性结合（与目标蛋白质，即“信号”）和非特异性结合（“噪声”）。
二抗 在冲洗膜以去除未结合的一抗后，将膜暴露于另一种抗体，该抗体针对一抗的物种特异性部分。抗体来自动物来源（或动物来源的杂交瘤培养物）；抗鼠二抗将与几乎所有鼠源性一抗结合，这使得整个实验室可以共享一个单一的大量生产的抗体来源，从而节省了一些成本，并提供更加一致的结果。这被称为二抗，由于其靶向特性，通常被称为“抗鼠”、“抗羊”等。二抗通常与生物素或报告酶（如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶）连接。这意味着多个二抗将与一个一抗结合，从而增强信号。最常见的是，使用与辣根过氧化物酶连接的二抗来裂解化学发光剂，反应产物产生的发光强度与蛋白质的量成正比。将一张灵敏的感光胶片放在膜上，曝光于反应产生的光线会产生抗体与印迹结合的图像。更便宜但灵敏度较低的方法使用 1% 过氧化氢的 4-氯萘酚染色；过氧化物自由基与 4-氯萘酚的反应产生深棕色染色，可以在不使用特殊感光胶片的情况下进行拍照。
在冲洗掉未结合的探针后，蛋白质印迹就可以准备好检测标记并与目标蛋白质结合的探针了。实际上，并非所有蛋白质印迹都在膜上的一个条带处显示蛋白质。通过将染色条带与电泳期间加载的标记或梯子的条带进行比较，可以获得大小近似值。该过程针对结构蛋白（如肌动蛋白或微管蛋白）重复进行，这些蛋白在样本之间不应发生变化。将目标蛋白的量索引到结构蛋白以控制组间。这种做法确保校正膜上总蛋白的量，以防出现错误或转移不完全。
显色检测 显色检测方法依赖于蛋白质印迹与底物的孵育，该底物与与二抗结合的报告酶（如过氧化物酶）反应。这将可溶性染料转化为不同颜色的不溶性形式，该形式在酶旁边沉淀下来，从而使膜染色。然后通过洗掉可溶性染料来停止印迹的显影。通过光密度法（染色的强度）或分光光度法评估蛋白质水平。
化学发光检测 化学发光检测方法依赖于蛋白质印迹与底物的孵育，该底物在暴露于二抗上的报告酶时会发光。然后通过感光胶片检测光线，而最近则是通过 CCD 相机检测光线，CCD 相机捕获蛋白质印迹的数字图像。通过光密度法分析图像，该方法评估蛋白质染色的相对量，并以光密度来量化结果。如果使用适当的标准，新的软件可以进行进一步的数据分析，例如分子量分析。
荧光检测 荧光标记的探针受到光的激发，然后通过配备有适当发射滤光片的 CCD 相机等光传感器检测激发的发射，该相机捕获蛋白质印迹的数字图像，并允许进行进一步的数据分析，例如分子量分析和定量蛋白质印迹分析。荧光被认为是蛋白质印迹分析中最灵敏的检测方法之一。
二次探测 硝酸纤维素膜和 PVDF 膜之间的主要区别之一是它们支持将抗体从膜上“剥离”并重复使用膜进行后续抗体探测的能力。虽然有完善的协议可用于剥离硝酸纤维素膜，但更坚固的 PVDF 膜更容易剥离，并且可以在背景噪声限制实验之前重复使用多次。另一个区别是，与硝酸纤维素不同，PVDF 必须在使用前浸泡在 95% 的乙醇、异丙醇或甲醇中。PVDF 膜也往往更厚，在使用过程中更耐损坏。