下一代测序 (NGS)/简介

关于本书

• 前四章是对生物信息学和特别是 NGS 的广泛概念的概括性介绍。它们是“必备先决条件”，将在本书的其余部分中被引用。
  • 在简介中，我们对该领域进行了几乎完整的概述，从测序技术、其特性、优势和劣势开始，涵盖它们可以检测的各种生物过程，最后以关于常见测序术语的部分结束。最后，我们以典型测序工作流程的概述结束。
  • 在大数据中，我们处理了一些在处理典型 NGS 数据量时出现的（也许意想不到的）困难。从在世界各地运送硬盘驱动器，到您计算机中需要多少内存才能在数据到达时组装数据，这些问题往往会让新手感到意外。我们将深入了解为解决这些问题而开发的文件格式、存档和算法。
  • 在外部的生物信息学中，我们将讨论生物信息学家使用的接口。我们将介绍带有文本界面和闪烁光标的命令行，但也介绍了专门为生物信息学管道开发的更友好的图形用户界面 (GUI)。
  • 在预处理中，我们将讨论控制 NGS 数据集质量和清除低质量数据的最佳实践。

• 接下来的五章描述了可以使用参考基因组序列进行的分析，假设有一个可用。
  • 在比对中，我们将讨论如何将一组读取映射到参考数据集。
  • 在DNA 变异中，我们将描述如何使用映射读取来调用变异（无论是 SNV、CNV 还是断点）。
  • 在RNA中，我们将解释如何从映射的 RNA-seq 读取中确定外显子、异构体和基因表达水平。
  • 在表观遗传学中，我们将描述用于确定表观遗传特征（如组蛋白或 CpG 甲基化）的拉下测定。
  • 在染色质结构中，我们将讨论用于确定染色质结构的技术，例如组蛋白的放置或当 DNA 位于细胞核中时不同染色体区域的物理邻近性。

• 最后，最后两章将描述在没有参考基因组的情况下进行的分析。
  • 从头组装将描述如何从 NGS 读取中组装基因组。
  • 从头 RNA 组装将解释如何仅从 NGS 读取中组装转录组。

简介

平台和技术

NGS 平台采用不同的技术来解码 DNA 中核苷酸的身份，或检测核苷酸上的甲基化等共价修饰。

NGS 平台发展迅速。通常，新技术和平台会在基因组生物学和技术进步 (AGBT) 大会上发布

出于教育目的，一些 2011 年发表的 NGS 平台综述。在此处阅读有关测序技术的更多信息 此处

文件格式和术语

FASTA

FASTA 格式，通常用后缀 .fa 或 .fasta 表示，是一种简单易懂的人类可读格式。通常，每个文件包含一组序列，其中每个序列由一行标题表示，以“>”字符开头，后跟相应的核苷酸序列，以多行常规宽度（通常为 60 或 80 个字符宽）显示。在实践中，某些工具可能会生成一个带有标题和单行长序列的序列。有关更详细的信息，请参阅 FASTA 维基百科页面。

FASTQ

FASTQ 是一种文本文件格式（人类可读），每个序列提供 4 行数据。

1. 序列标识符
2. 序列
3. 注释
4. 质量得分

FASTQ 格式通常用于存储测序读取，特别是来自 Illumina 和 Ion Torrent 平台的读取。

配对端读取可以存储在一个 FASTQ 文件（交替）中或两个不同的 FASTQ 文件中。配对端读取的序列标识符可能分别以“/1”和“/2”结尾。

一个 Illumina 读取的示例 FASTQ 条目

@EAS20_8_6_1_3_1914/1
CGCGTAACAAAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAGCATTTTTATCCATAAGATT
+
HHHHHHHHHFHGGHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHEHHHHHHHHHHHHHHGHHHGHHHGHIHHHHHHHHHHHHHHHGCHHHHFHHHHHHHGGGCFHBFBCCF

通常，FASTQ 文件存储在以 .fq 或 .fastq 为后缀的文件中，使用 Gzip 文件压缩，以 .gz 或 .gzip 为后缀表示。

有关更详细的信息，请参阅 FASTQ 维基百科页面。

SFF

SFF 是一种二进制文件格式，用于编码来自 454 平台的测序读取。

http://en.wikipedia.org/wiki/Standard_Flowgram_Format

SAM/BAM

用于编码短读取比对的文件格式。有关更多信息，请参阅 下一代测序 (NGS)/比对。

FASTG

FASTG 是一种新兴的基因组组装文件格式，它考虑了模糊性。FASTG 类似于 FASTA，但 G 代表“图”。

VCF

变异调用格式 (VCF) 是生物信息学中用于存储基因序列变异的规范。有关更多信息，请参见 [1]。

读取长度

截至 2013 年 2 月，第二代测序平台的读取长度短于传统的桑格测序，这给读取比对和组装带来了挑战。

• 使用最广泛的 Illumina 平台可以产生高达 250bp 的读取长度。在实践中，全球研究人员大多可以访问约 100bp 的读取长度。
• Ion Torrent：变化很大，通常峰值为 400bp
• SOLiD：50-75bp

配对/单端

• 单端读取表示序列片段仅从一个方向进行测序。
• 在配对末端测序中，单个片段从 5' 端和 3' 端进行测序，产生正向和反向读取。测序的片段可以通过一定数量的碱基（内部插入大小）分隔开，或者可以重叠，在合并后产生一个连续的更长的单端片段。配对末端读取的使用可以提高读取比对到参考基因组的准确性。典型的片段大小（外部插入大小）为 200bp 至 500bp

匹配对

匹配对与配对末端在测序文库构建方式上有所不同。在匹配对测序中，选择 2-5kb 的片段并从两端进行测序，从而提供关于相距较远的核苷酸如何连接在一起的信息。匹配对更适合于研究基因组结构重排，并有助于从头基因组组装。它们还有助于在更宽的 SV 尺寸范围内以及基因组的重复区域中进行灵敏的结构变异 (SV) 检测。

颜色空间

颜色空间是由 Life Tech 商业化的 2-碱基编码系统，并用于 SOLiD 平台。技术概述见 此处。

质量得分

质量分数表示碱基调用错误的概率。质量分数用于 FASTQ 格式。

有多种编码方案可用，包括最常见的 [Phred 质量分数]。

NGS 的用途

DNA

查找肿瘤细胞中的突变。

RNA

使用逆转录重建转录组（基于基因组或从头），以便研究人员可以计算有多少读取与转录组的注释部分比对。这用于比较彼此差异显著的样本中的基因表达，并构建生物体的生化途径。

ChIP

染色质免疫沉淀测序 (ChIP-seq) 是一种用于分析蛋白质与 DNA 相互作用的方法。ChIP-seq 将染色质免疫沉淀 (ChIP) 与大规模平行 DNA 测序相结合，以识别 DNA 相关蛋白的结合位点。它可用于精确绘制任何感兴趣蛋白的全局结合位点。以前，ChIP-on-chip 是研究这些蛋白质-DNA 关系最常用的技术。