DNA 聚合酶在 DNA 链的 5' 端添加核苷酸。[1] 如果意外掺入了错配,则聚合酶会被抑制,无法继续延伸。校对功能会移除错配的核苷酸,并继续延伸。
DNA 复制是发生在所有生物体中的生物学过程,复制它们的 DNA;它是生物遗传的基础。该过程从一个双链 DNA 分子开始,产生两个相同拷贝的分子。原始双链 DNA 分子的每条链都作为模板来产生互补链。细胞校对和错误校正机制确保 DNA 复制具有近乎完美的保真度。在细胞中,DNA 复制从基因组中的特定位置开始,称为“起点”。在起点处 DNA 解旋,以及新链的合成,形成复制叉。除了 DNA 聚合酶(通过添加与模板链匹配的核苷酸来合成新 DNA 的酶)之外,许多其他蛋白质与复制叉相关联,并辅助 DNA 合成的起始和延续。DNA 复制也可以在体外(人工,在细胞外)进行。从细胞中分离出来的 DNA 聚合酶和人工 DNA 引物用于在模板分子中已知序列处启动 DNA 合成。聚合酶链式反应(PCR)是一种常见的实验室技术,它以循环方式使用这种人工合成来从 DNA 池中扩增特定的靶 DNA 片段[2]。
在细胞中,DNA 复制从基因组中的特定位置开始,称为“起点”。在起点处 DNA 解旋,以及新链的合成,形成复制叉。除了 DNA 聚合酶(通过添加与模板链匹配的核苷酸来合成新 DNA 的酶)之外,许多其他蛋白质与复制叉相关联,并辅助 DNA 合成的起始和延续。DNA 复制也可以在体外(在细胞外)进行。从细胞中分离出来的 DNA 聚合酶和人工 DNA 引物用于在模板分子中已知序列处启动 DNA 合成。聚合酶链式反应(PCR)是一种常见的实验室技术,它以循环方式使用这种人工合成来从 DNA 池中扩增特定的靶 DNA 片段。
领先链模板是 DNA 双螺旋的模板链,其方向为 3' 到 5'。所有 DNA 合成都发生在 5'-3'。原始 DNA 链必须以 3'-5' 方向读取才能产生 5'-3' 新生链。领先链沿领先链模板形成,因为聚合酶“读取”模板 DNA 并不断地将核苷酸添加到正在延伸的链的 3' 端。这种聚合酶是原核生物中的 DNA 聚合酶 III(DNA Pol III),据推测是真核生物中的 Pol ε。
滞后链模板是 DNA 双螺旋的编码链,其方向为 5' 到 3'。新合成的滞后链仍然以 5'-3' 方向合成。但是,由于 DNA 的方向不允许连续合成,因此一次只能读取一小段。一个 RNA 引物被放置在 DNA 链上,该链位于复制起点 3' 处。与以前一样,DNA 聚合酶以 3'-5' 方向读取原始 DNA,以产生 5'-3' 新生链。聚合酶到达复制起点并停止复制,直到一个新的 RNA 引物被放置在最后一个 RNA 引物 3' 处。在滞后链上产生的这些 DNA 片段被称为冈崎片段。滞后链上原始 DNA 的方向阻止了连续合成。因此,滞后链的复制比领先链更复杂。在滞后链模板上,引物酶“读取”DNA 并将其上的 RNA 添加到短的、分离的片段中。在真核生物中,引物酶是 Pol α 的固有部分。DNA 聚合酶 III 或 Pol δ 延长了引物片段,形成了冈崎片段。真核生物中引物的去除也是由 Pol δ 完成的。在原核生物中,DNA 聚合酶 I “读取”这些片段,使用其瓣状核酸内切酶结构域去除 RNA,并用 DNA 核苷酸替换 RNA 核苷酸(这是必要的,因为 RNA 和 DNA 使用略微不同的核苷酸)。DNA 连接酶将这些片段连接在一起。
1. A 家族聚合酶包含复制和修复聚合酶。来自该家族的复制成员包括经过广泛研究的 T7 DNA 聚合酶,以及真核生物线粒体 DNA 聚合酶 γ。修复聚合酶中包括大肠杆菌 DNA pol I、嗜热栖热菌 pol I 和嗜热脂肪芽孢杆菌 pol I。这些修复聚合酶参与切除修复和滞后链合成过程中产生的冈崎片段的加工。
2. B 家族在 XPV 患者中,备用易错聚合酶,例如 Pol ζ(zeta)(聚合酶 ζ 是 B 家族聚合酶,是催化亚基 REV3L 与 Rev7 的复合物,与 Rev1 相关联),被认为参与导致这些患者癌症易感性的错误。属于 B 家族的 DNA 聚合酶包含 DTDS 基序。其他成员是 Pol ε、Pol α、Pol δ。
3. C 家族聚合酶是主要的细菌染色体复制酶。来自大肠杆菌的 DNA 聚合酶 III α 亚基是催化亚基,没有已知的核酸酶活性。另一个亚基,ε 亚基,具有在染色体复制过程中用于编辑的 3'-5' 外切核酸酶活性。最近的研究已将 C 家族聚合酶归类为 X 家族的子类别。
4. D 家族聚合酶的特征仍然不太清楚。所有已知的例子都存在于古细菌域的广古菌亚域,被认为是复制聚合酶。
5.X 家族 包含著名的真核聚合酶 pol β,以及其他真核聚合酶,如 pol σ、pol λ、pol μ 和末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT)。Pol β 是短片段碱基切除修复所必需的,这是一种 DNA 修复途径,对于修复无碱基位点至关重要。Pol λ 和 Pol μ 参与非同源末端连接,这是一种重新连接 DNA 双链断裂的机制。TdT 仅在淋巴组织中表达,并在 V(D)J 重组过程中形成的双链断裂处添加“n 个核苷酸”,以促进免疫多样性。酵母菌 Saccharomyces cerevisiae 只有一个 Pol X 聚合酶,Pol IV,参与非同源末端连接。
6.Y 家族Y 聚合酶在无损模板上的保真度较低,并且能够复制穿过受损的 DNA。 因此,这个家族的成员被称为跨损伤合成 (TLS) 聚合酶。根据损伤,TLS 聚合酶可以以无误或易错的方式绕过损伤,后者会导致突变率升高。例如,色素性干皮病变异型 (XPV) 患者的 Pol η (η) 编码基因发生突变,该基因对紫外线损伤无错。人类的其他成员是 Pol ι (ι)、Pol κ (κ) 和 Rev1 (末端脱氧胞嘧啶转移酶)。在大肠杆菌中,已知两种 TLS 聚合酶,Pol IV (DINB) 和 Pol V (UmuD'2C)。
7.逆转录酶 (RT) 家族 逆转录酶家族包含来自逆转录病毒和真核聚合酶的例子。真核聚合酶通常仅限于端粒酶。这些聚合酶使用 RNA 模板合成 DNA 链。
保守 假说提出,整个 DNA 分子充当合成一个全新 DNA 分子的模板。根据这个模型,组蛋白 蛋白质与 DNA 结合,以这样的方式扭曲 DNA,以便为氢键暴露两条链的碱基 [9]。
分散 假说以 马克斯·德尔布吕克 提出的模型为例,该模型试图通过一种机制来解决解开双螺旋的两条链的问题,这种机制每 10 个核苷酸左右就会断裂一次 DNA 骨架,解开分子,并将旧链连接到新合成的链的末端。这将在短片段中合成 DNA,这些片段在一条链和另一条链之间交替 [10]。
这三种模型中的每一种对复制后形成的分子中“旧”DNA 的分布做出了不同的预测。在保守假说中,复制后,一个分子是完全保留的“旧”分子,另一个分子是全部新合成的 DNA。半保留假说预测,复制后的每个分子将包含一条旧链和一条新链。分散模型预测,每个新分子的每条链将包含旧 DNA 和新 DNA 的混合物 [11]。
半保留理论可以通过利用 DNA 由氮碱基组成的这一事实来证实。氮具有称为重氮的同位素 N15 (N14 是最常见的同位素)。证实半保留理论的预测的实验利用了这种同位素,并按如下步骤进行:细菌 (大肠杆菌) DNA 被放置在含有重氮 (N15) 的培养基中,重氮与 DNA 结合,使其可识别。然后将这种 DNA 放置在含有 N14 的培养基中,并使其仅复制一次。新的碱基将包含氮 14,而原来的将包含 N15。将 DNA 放置在含有氯化铯 (重化合物) 的试管中,并在 40,000 转/分钟的速度下离心。氯化铯分子沉到底部,形成密度梯度。DNA 分子将定位在其相应的密度水平 (考虑到 N15 比 N14 密度更大)。在紫外线下观察这些试管。DNA 在试管中以不同高度出现,具体取决于它们的密度。根据半保留理论,在 DNA 复制一次后,我们应该从 DNA 的每条原始链中获得 2 个杂交 (部分 N14 部分 N15) 分子。这将在试管中显示为一条线。分散理论的结果将相同。另一方面,根据保守理论,我们应该获得一条原始 DNA 链和一条全新的链,即试管中分别放置的两条细线。到目前为止,半保留理论或分散理论可能是真实的,因为实验证据证实,在复制一次后只出现一条线。为了得出这两个理论之间的结论,必须让 DNA 再次复制,仍然在含有 N14 的培养基中。在分散理论中,经过 2 次分裂后,我们应该获得一条线,但试管中更高,因为 DNA 分子随着 N14 在分子中变得更加丰富而变得密度更低。根据半保留理论,应该产生 2 个杂交分子和 2 个完全 N14 分子,因此在试管中应该观察到不同高度的两条细线。实验证据证实,观察到两条线,因此为半保留理论提供了有力的证据 [12]。
遗传证据
最近,对单个突变细菌进行的高通量基因组测序提供了对半保留理论的独立“遗传”证据。大肠杆菌 被甲磺酸乙酯 (EMS) 处理,已知 EMS 会诱导 G:C → A:T 转换,因为会生成异常碱基 O-6-乙基鸟嘌呤,该碱基在 DNA 复制过程中会被错误识别并与 T 配对而不是 C。来自 EMS 突变细菌的单个菌落的测序 DNA 表明,仅 G → A 或 C → T 转换的长片段,在某些情况下跨越了整个细菌基因组。对这种现象的基本解释基于半保留机制:人们应该预期子链在复制后分离到不同的细胞中,这会导致每个后代细胞仅具有 G → A 或 C → T 转换。
氮 是 DNA 的主要组成部分。14N 迄今为止是氮最丰富的同位素,但带有较重 (但非放射性) 15N 同位素的 DNA 也是功能性的。
大肠杆菌 在含有 15N 的培养基中生长了多代。当从这些细胞中提取 DNA 并将其在盐密度梯度上离心时,DNA 会在密度等于盐溶液密度的点分离。在 15N 培养基中生长的细胞的 DNA 比在正常 14N 培养基中生长的细胞的 DNA 密度更高。之后,将只有 15N DNA 的 大肠杆菌 细胞转移到 14N 培养基中,并允许其分裂;通过测量细胞悬浮液的光密度来监测细胞分裂的进程。
定期提取 DNA,并将其与纯 14N DNA 和 15N DNA 进行比较。复制一次后,发现 DNA 的密度接近中间值。由于保守复制会导致等量的较高和较低密度的 DNA (但没有中间密度的 DNA),因此排除了保守复制。但是,此结果与半保留复制和分散复制是一致的。半保留复制将导致双链 DNA,其中一条链是 15N DNA,另一条是 14N DNA,而分散复制将导致双链 DNA,其中两条链都具有 15N 和 14N DNA 的混合物,两者都将显示为中间密度的 DNA。
作者继续对细胞进行采样,以继续复制。发现已完成两次复制的细胞的 DNA 由等量的两种不同密度的 DNA 组成,一种对应于在 14N 培养基中仅分裂一次的细胞的 DNA 的中间密度,另一种对应于仅在 14N 培养基中生长的细胞的 DNA。这与分散复制不一致,分散复制会导致单一密度,低于一代细胞的中间密度,但仍高于仅在 14N DNA 培养基中生长的细胞的密度,因为原始 15N DNA 会均匀地分布在所有 DNA 链中。结果与半保留复制假设一致 [13]。
真核生物中的 DNA 复制比原核生物中的复杂得多,尽管存在许多相似的方面。真核细胞只能在细胞周期的特定时间点,即S 期开始时启动 DNA 复制。
真核生物的 DNA 复制仅发生在细胞周期的 S 期。然而,预起始发生在 G1 期。因此,预起始和激活的分离确保了复制起点只能在每个细胞周期中启动一次。由于真核生物染色体体积庞大,真核生物染色体包含**多个复制起点**。有些起点得到很好的表征,例如酵母的**自主复制序列 (ARS)**,而其他真核生物的起点,特别是后生动物的起点,可以在数千个碱基对的范围内找到[14]。
POLA1, POLA2: Pol α(也称为 RNA 引物酶):与一个小的催化亚基 (PriS) 和一个大的非催化亚基 (PriL) 形成复合物,Pri 亚基充当引物酶(合成 RNA 引物),然后 DNA Pol α 用 DNA 核苷酸延伸该引物。大约 20 个核苷酸后[3],延伸由 Pol ε(在引导链上)和 δ(在滞后链上)接管。
POLB: Pol β:参与修复 DNA,包括碱基切除修复和缺口填充合成。
POLG, POLG2: Pol γ:复制和修复线粒体 DNA,并具有校对 3'->5' 核酸外切酶活性。
POLD1, POLD2, POLD3, POLD4: Pol δ:具有高度的加工能力,并具有校对 3'->5' 核酸外切酶活性。被认为是参与滞后链合成的主要聚合酶,但其作用仍存在争议。
POLE, POLE2, POLE3: Pol ε:也是高度加工的,并具有校对 3'->5' 核酸外切酶活性。与 Pol δ 非常相似,被认为是参与引导链合成的主要聚合酶[5],但其作用再次存在争议。
POLH, POLI, POLK, : η、ι、κ 和 Rev1 是 Y 家族 DNA 聚合酶,Pol ζ 是 B 家族 DNA 聚合酶。这些聚合酶参与绕过 DNA 损伤。
引物体包含**七种蛋白**:**DnaG** 引物酶、**DnaB** 解旋酶、**DnaC** 解旋酶辅助蛋白、**DnaT、PriA、Pri B** 和**PriC**。引物体在 DNA 引导链上使用一次,在滞后 DNA 链上重复使用,启动每个冈崎片段。最初,由**PriA、PriB 和 PriC** 形成的复合物与 DNA 结合。然后,DnaB-DnaC 解旋酶复合物与**DnaT** 一起附着。这种结构被称为**预引物体**。最后,**DnaG** 将与预引物体结合形成完整的引物体。引物体将 1-10 个 RNA 核苷酸附着到单链 DNA 上,创建一个 DNA-RNA 杂交体。该 RNA 序列被用作引物来启动 DNA 聚合酶 III。RNA 碱基最终被 RNase H 核酸酶(真核生物)或 DNA 聚合酶 I 核酸酶(原核生物)替换为 DNA 碱基。然后,DNA 连接酶起作用将两端连接在一起。
一旦引物完成,DNA 聚合酶 III 全酶就被加载到 DNA 中,复制开始。DNA 聚合酶 III 的催化机制涉及在活性位点使用两种金属离子,以及活性位点中一个能够区分脱氧核苷酸和核苷酸的区域。金属离子是一般二价阳离子,它们帮助 3' OH 启动对脱氧核苷酸的α磷酸的亲核攻击,并定位和稳定脱氧核苷酸上的带负电的磷酸三酯。3' OH 对α磷酸的亲核攻击释放焦磷酸,然后焦磷酸被无机磷酸酶水解成两个磷酸。这种水解促使 DNA 合成完成。
此外,DNA 聚合酶 III 必须能够区分正确配对的碱基和错误配对的碱基。这是通过使用一个形状与正确配对核苷酸结构互补的活性位点口袋来区分沃森-克里克碱基对来实现的。这个口袋有一个酪氨酸残基,能够与正确配对的核苷酸形成范德华相互作用。此外,活性位点的 dsDNA(双链 DNA)具有更宽、更浅的次要沟,允许与嘌呤碱基的第三个氮原子和嘧啶碱基的第二个氧原子形成氢键。最后,活性位点与 DNA 骨架形成大量的氢键。这些相互作用导致 DNA 聚合酶 III 围绕一个正确配对的碱基闭合。如果插入一个碱基并且错误配对,这些相互作用将无法发生,因为氢键和范德华相互作用会受到干扰。
DNA 以 3' → 5' 方向读取,因此,核苷酸以 5' → 3' 方向合成(或连接到模板链)。然而,一条亲本 DNA 链是 3' → 5',而另一条是 5' → 3'。为了解决这个问题,复制在相反的方向进行。朝向复制叉移动,**引导链以连续的方式合成**,只需要一个引物。另一方面,**滞后链**,远离复制叉移动,以一系列**称为冈崎片段的短片段**合成,因此需要多个引物。冈崎片段的 RNA 引物随后被 RNAse H 和 DNA 聚合酶 I(核酸外切酶)降解,缺口(或切口)被脱氧核苷酸填充,并通过连接酶密封。
大肠杆菌 DNA 复制的终止是通过使用终止序列和Tus蛋白完成的。Tus 是一种序列特异性 DNA 结合蛋白,它促进原核生物 DNA 复制的终止。在大肠杆菌中,Tus 结合细菌染色体中编码的十个密切相关的 23 个碱基对结合位点。这些位点称为Ter 位点,分别命名为TerA、TerB、…、TerJ。结合位点是不对称的,因此当一个 Tus-Ter 复合物(Tus 蛋白与 Ter 位点结合)遇到来自一个方向的复制叉时,该复合物会解离,复制继续进行(允许的)。然而,当从另一个方向遇到时,Tus-Ter 复合物提供了更大的动力学屏障,并停止了复制(不允许的)。染色体中的多个 Ter 位点是定向的,使得两个相反方向移动的复制叉都在所需的终止区域停滞。
绝大多数 DNA 损伤影响双螺旋结构的主要结构;也就是说,碱基本身被化学修饰。这些修饰反过来可以通过引入非天然化学键或不适合标准双螺旋结构的庞大加合物来破坏分子的规则螺旋结构。与蛋白质和 RNA 不同,DNA 通常缺乏三级结构,因此损伤或干扰不会发生在该级别。然而,DNA 是超螺旋的,并缠绕在称为组蛋白的“包装”蛋白周围(在真核生物中),两种超结构都容易受到 DNA 损伤的影响[17]。
直接 DNA 损伤:UV 光子被 DNA 直接吸收(左)。激发态可能发生的反应之一是形成胸腺嘧啶-胸腺嘧啶环丁烷二聚体(右)。直接 DNA 损伤会导致晒伤,导致黑色素生成增加,从而导致持久性晒黑。然而,它仅占所有黑色素瘤的 8%。
由于内源性细胞过程,DNA 损伤主要有五种类型:碱基氧化 [例如 8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤 (8-oxoG)] 和活性氧物种产生的 DNA 链断裂,碱基烷基化(通常是甲基化),例如形成 7-甲基鸟嘌呤、1-甲基腺嘌呤、6-O-甲基鸟嘌呤,碱基水解,例如脱氨基、脱嘌呤和脱嘧啶。“庞大加合物的形成”(即苯并 [a] 芘二醇环氧化物-dG 加合物)碱基错配,由于 DNA 复制错误,其中错误的 DNA 碱基缝合到新形成的 DNA 链中,或者 DNA 碱基被跳过或错误地插入。由外源性因素造成的损伤 由外源性因素造成的损伤形式多种多样。以下描述了一些示例。
UV-B 光会导致相邻胞嘧啶和胸腺嘧啶碱基之间发生交联,形成嘧啶二聚体。这称为直接 DNA 损伤。
UV-A 光主要产生自由基。自由基造成的损伤称为间接 DNA 损伤。
电离辐射(如放射性衰变或宇宙射线产生的辐射)会导致 DNA 链断裂。低剂量电离辐射可能诱导不可修复的 DNA 损伤(导致肿瘤形成所需的复制和转录错误,或可能触发病毒相互作用),从而导致早衰和癌症。
高温下的热扰动会增加脱嘌呤(从 DNA 骨架中丢失嘌呤碱基)和单链断裂的速率。例如,水解脱嘌呤在嗜热菌中可见,嗜热菌在 40-80 °C 的温泉中生长。这些物种中的脱嘌呤率(每个基因组每个世代 300 个嘌呤残基)太高,无法通过正常的修复机制修复,因此不能排除适应性反应的可能性。
工业化学品在 DNA 损伤中也起着非常重要的作用,例如氯乙烯和过氧化氢,以及环境化学品,例如在烟雾、烟灰和焦油中发现的多环芳烃,会产生大量的 DNA 加合物——乙烯碱基、氧化碱基、烷基化磷酸三酯和 DNA 交联,仅举几例。UV 损伤、烷基化/甲基化、X 射线损伤和氧化损伤是诱导损伤的例子。自发性损伤可能包括碱基丢失、脱氨基、糖环扭结和互变异构体转换[18]。
图 1:PCR 循环的示意图。(1)在 94–96 °C 下变性。 (2)在 ~65 °C 下退火 (3)在 72 °C 下延伸。这里显示了四个循环。蓝线代表 DNA 模板,引物(红色箭头)与之退火,这些引物由 DNA 聚合酶(浅绿色圆圈)延伸,得到更短的 DNA 产物(绿色线),这些产物本身用作 PCR 进程中的模板。
1971 年,Kleppe 及其同事在《分子生物学杂志》上发表了一篇论文,首次描述了一种使用酶法分析在体外用引物复制短 DNA 模板的方法。然而,这种早期体现 PCR 基本原理的方法并没有引起太多关注,1983 年发明的聚合酶链式反应(PCR)通常被认为是 Kary Mullis 的功劳。PCR 方法的核心是使用合适的 DNA 聚合酶,这种聚合酶能够承受超过 90 °C(194 °F)的高温,这些高温是每次复制循环后使 DNA 双螺旋中的两条 DNA 链分离所需的。最初用于 PCR 预兆的体外实验的 DNA 聚合酶无法承受这些高温。因此,早期的 DNA 复制程序效率很低,耗时长,需要大量的 DNA 聚合酶,并且在整个过程中需要持续操作。1976 年发现的 Taq 聚合酶是一种从嗜热细菌——热泉菌中提取的 DNA 聚合酶,这种细菌自然生长在温泉等高温(50 到 80 °C(122 到 176 °F))的环境中,为 PCR 方法的显著改进铺平了道路。从热泉菌中分离出的 DNA 聚合酶在高温下稳定,即使在 DNA 变性后也能保持活性,因此无需在每次循环后添加新的 DNA 聚合酶。这使得基于自动热循环仪的 DNA 扩增过程成为可能。当 Mullis 在 1983 年开发 PCR 时,他在加州埃默里维尔为 Cetus 公司工作,Cetus 公司是第一批生物技术公司之一。在那里,他负责合成短链 DNA。Mullis 在他的著作中写道,他是在一个晚上开车沿着太平洋海岸公路行驶时想到 PCR 的。他当时正在思考分析 DNA 变化(突变)的新方法,这时他意识到,他发明了一种通过 DNA 聚合酶驱动的重复复制循环来扩增任何 DNA 区域的方法。在《科学美国人》杂志上,Mullis 总结了这种方法:“从单个遗传物质 DNA 分子开始,PCR 可以在一个下午内产生 1000 亿个类似的分子。这种反应很容易执行,只需要一个试管、一些简单的试剂和一个热源。”他于 1993 年因其发明获得了诺贝尔化学奖,这是他和他 Cetus 公司的同事首次将他的提议付诸实践七年后。然而,关于其他科学家对 Mullis 工作的智力和实际贡献,以及他是否为 PCR 原理的唯一发明者,一直存在一些争议[19]。
PCR
PCR 用于扩增 DNA 链的特定区域(DNA 目标)。大多数 PCR 方法通常扩增长达约 10 千碱基对 (kb) 的 DNA 片段,尽管某些技术允许扩增长达 40 kb 的片段。基本的 PCR 设置需要几种组分和试剂。这些组分包括
含有待扩增 DNA 区域(目标)的 DNA 模板。
两个引物,它们分别与 DNA 目标的正义链和反义链的 3'(3 素)末端互补。Taq 聚合酶或其他在约 70 °C 下具有最佳温度的 DNA 聚合酶。脱氧核苷酸三磷酸 (dNTP),这是 DNA 聚合酶合成新的 DNA 链的构建块。缓冲液,为 DNA 聚合酶提供最佳活性及稳定性的合适化学环境。二价阳离子,镁或锰离子;通常使用 Mg2+,但 Mn2+ 可用于 PCR 介导的 DNA 诱变,因为更高的 Mn2+ 浓度会增加 DNA 合成过程中的错误率。一价阳离子钾离子。PCR 通常在热循环仪中以 10-200 μl 的反应体积进行,在小反应管(0.2-0.5 ml 体积)中进行。热循环仪对反应管进行加热和冷却,以在反应的每个步骤(见下文)实现所需的温度。许多现代热循环仪利用珀耳帖效应,通过简单地反转电流就可以加热和冷却容纳 PCR 管的块体。薄壁反应管允许良好的热传导,从而实现快速热平衡。大多数热循环仪都有加热盖,以防止反应管顶部出现冷凝。没有加热盖的旧热循环仪需要在反应混合物顶部加一层油,或者在管内放一个蜡球[20]。
程序
图 1:PCR 循环的示意图。(1) 在 94-96 °C 下变性。(2) 在约 65 °C 下退火。(3) 在 72 °C 下延伸。这里显示了四个循环。蓝色线代表 DNA 模板,引物(红色箭头)与之退火,并被 DNA 聚合酶(浅绿色圆圈)延伸,以产生较短的 DNA 产物(绿色线),这些产物本身在 PCR 过程中用作模板。通常,PCR 由一系列 20-40 次重复的温度变化(称为循环)组成,每个循环通常包括 2-3 个离散的温度步骤,通常是三个步骤。循环通常在高温(>90°C)下进行一个单一温度步骤(称为保持)开始,然后在最后进行一个保持,以进行最终产物延伸或短暂保存。使用的温度以及它们在每个循环中应用的时间取决于各种参数。这些参数包括用于 DNA 合成的酶、反应中二价离子和 dNTP 的浓度以及引物的熔解温度 (Tm)。初始化步骤:此步骤包括将反应加热到 94-96 °C(或如果使用极度耐热聚合酶则为 98 °C),并保持 1-9 分钟。这仅适用于需要通过热启动 PCR 热激活的 DNA 聚合酶。变性步骤:这是第一个常规循环事件,包括将反应加热到 94-98 °C 并保持 20-30 秒。它通过破坏互补碱基之间的氢键来导致 DNA 模板变性,从而产生单链 DNA 分子。退火步骤:反应温度降至 50-65 °C 并保持 20-40 秒,允许引物与单链 DNA 模板退火。通常,退火温度比所用引物的 Tm 低约 3-5 摄氏度。只有当引物序列与模板序列非常匹配时,才会形成稳定的 DNA-DNA 氢键。聚合酶与引物-模板杂交体结合并开始 DNA 合成。延伸/延长步骤:此步骤的温度取决于所使用的 DNA 聚合酶;Taq 聚合酶在其最佳活性温度在 75-80 °C,并且通常使用这种酶时使用 72 °C 的温度。在此步骤中,DNA 聚合酶通过添加与模板互补的 dNTP 来合成与 DNA 模板链互补的新 DNA 链,这些 dNTP 在 5' 到 3' 方向上与新合成(延伸)的 DNA 链末端的 3'-羟基缩合。延伸时间取决于所使用的 DNA 聚合酶和待扩增的 DNA 片段的长度。作为经验法则,在其最佳温度下,DNA 聚合酶每分钟会聚合一千个碱基。在最佳条件下,即如果没有由于限制性底物或试剂造成的限制,则在每个延伸步骤中,DNA 目标的量都会翻倍,从而导致特定 DNA 片段的指数(几何)扩增。最终延伸:此单一步骤偶尔在最后一个 PCR 循环后在 70-74 °C 下进行 5-15 分钟,以确保任何剩余的单链 DNA 完全延伸。最终保持:此步骤在 4-15 °C 下进行无限时间,可用于短时间保存反应。
为了检查 PCR 是否产生了预期的 DNA 片段(有时也称为扩增子或扩增子),采用琼脂糖凝胶电泳来分离 PCR 产物的尺寸。通过与 DNA 梯子(分子量标记)进行比较来确定 PCR 产物的尺寸,DNA 梯子包含已知尺寸的 DNA 片段,与 PCR 产物一起在凝胶上运行[21]。