生物化学原理/柠檬酸循环或三羧酸循环

柠檬酸循环——也被称为三羧酸循环（TCA循环）、克雷伯循环或圣捷尔吉-克雷伯循环——是一系列酶促化学反应，对于所有使用氧气作为细胞呼吸一部分的活细胞来说都至关重要。在真核细胞中，柠檬酸循环发生在线粒体的基质中。柠檬酸循环的成分和反应是由阿尔伯特·圣捷尔吉和汉斯·克雷伯的开创性工作确定的。在需氧生物中，该循环是参与将碳水化合物、脂肪和蛋白质化学转化为二氧化碳和水的代谢途径的一部分，以产生一种可利用的能量形式。该途径中的其他相关反应包括糖酵解和丙酮酸氧化，它们发生在柠檬酸循环之前，以及氧化磷酸化，它发生在柠檬酸循环之后。此外，它还提供许多化合物的先驱，包括一些氨基酸，因此即使在进行发酵的细胞中也是功能性的。

柠檬酸循环概述

柠檬酸循环途径中的酶

柠檬酸合酶

柠檬酸合酶（E.C. 2.3.3.1 [以前为 4.1.3.7]）存在于几乎所有活细胞中，是柠檬酸循环（或克雷伯循环）第一步的限速酶。柠檬酸合酶位于真核细胞的线粒体基质中，但由核DNA而不是线粒体编码。它由胞质核糖体合成，然后被转运到线粒体基质中。柠檬酸合酶通常用作完整线粒体存在的定量酶标记。柠檬酸合酶催化来自乙酰辅酶 A 的双碳乙酸残基和四碳草酰乙酸分子缩合形成六碳柠檬酸的反应。草酰乙酸将在克雷伯循环完成一轮后再生。

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  乙酰辅酶 A
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  草酰乙酸
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  柠檬酸

乙酰辅酶 A + 草酰乙酸 + H₂O → 柠檬酸 + CoA-SH

草酰乙酸是第一个与酶结合的底物。这会导致酶改变其构象，并创建一个乙酰辅酶 A 结合位点。只有当这种柠檬酰辅酶 A 形成后，另一种构象变化才会导致硫酯水解并释放辅酶 A。这确保了从硫酯键断裂中释放的能量将驱动缩合反应。

异柠檬酸分解为草酰琥珀酸，然后分解为最终产物α-酮戊二酸的催化机制。草酰琥珀酸中间体是假设的；它从未在该酶的脱羧版本中被观察到。

乌头酸酶

乌头酸酶（乌头酸水合酶；EC 4.2.1.3）是一种催化柠檬酸通过顺乌头酸立体特异性异构化为异柠檬酸的酶，这是一种非氧化还原反应。

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  柠檬酸
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  乌头酸
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  异柠檬酸

异柠檬酸脱氢酶

异柠檬酸脱氢酶（EC 1.1.1.42）和（EC 1.1.1.41），也称为 IDH，是一种参与柠檬酸循环的酶。它催化循环的第三步：异柠檬酸的氧化脱羧，产生α-酮戊二酸（α-酮戊二酸）和 CO2，同时将 NAD+ 转换为 NADH。这是一个两步过程，包括将异柠檬酸（仲醇）氧化为草酰琥珀酸（酮），然后将β-酮的羧基脱羧，形成α-酮戊二酸。该酶的另一种亚型催化相同的反应，但此反应与柠檬酸循环无关，在线粒体和过氧化物酶体中以及胞质溶胶中进行，并使用 NADP+ 而不是 NAD+ 作为辅因子。

在柠檬酸循环中，由柠檬酸异构化产生的异柠檬酸会发生氧化和脱羧。使用异柠檬酸脱氢酶 (IDH) 酶，异柠檬酸被周围的精氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸和天冬氨酸氨基酸固定在其活性位点内。第一个框显示了异柠檬酸脱氢酶的总体反应。该酶机制发挥作用所需的反应物是异柠檬酸、NAD+/NADP+ 和 Mn2+ 或 Mg2+。反应产物是α-酮戊二酸、二氧化碳和 NADH + H+/NADPH + H+。水分子用于帮助异柠檬酸的氧气（O3）去质子化。第二个框是步骤 1，即α-C（C#2）的氧化。氧化是异柠檬酸经历的第一步。在此过程中，α-碳（C#2）上的醇基团被去质子化，电子流向α-C，形成酮基，并使用 NAD+/NADP+ 作为电子接受辅因子从 C#2 上除去一个氢化物。α-C 的氧化提供了电子（在下一步中）从羧基向下流动并推动电子（使双键氧气）向上回到氧气或从附近的赖氨酸氨基酸上获取附近质子的位置。第三个框是步骤 2，即草酰琥珀酸的脱羧。在此步骤中，羧基氧气被附近的酪氨酸氨基酸去质子化，这些电子流向碳 2。二氧化碳作为离去基团离开异柠檬酸的β碳，电子流向α-C 上的酮氧气，在α-C 的氧气上放置负电荷，并在碳 2 和 3 之间形成α-β不饱和双键。α-C 氧气上的孤对电子从附近的赖氨酸氨基酸中获取一个质子。第四个框是步骤 3，即α-β不饱和双键（碳 2 和 3 之间）的饱和。在反应的这一步中，[5][6]赖氨酸去质子化α碳上的氧气，α碳上氧气的孤对电子向下重新形成酮双键，并推动形成α和β碳之间双键的孤对电子离开，从附近的酪氨酸氨基酸中获取一个质子。此反应导致形成α-酮戊二酸、NADH + H+/NADPH + H+ 和 CO2。

α-酮戊二酸脱氢酶

酮戊二酸脱氢酶复合物 (OGDC) 或 α-酮戊二酸脱氢酶复合物是一种酶复合物，最常因其在柠檬酸循环中的作用而闻名。该酶在柠檬酸循环中催化的反应是

α-酮戊二酸 + NAD⁺ + CoA → 琥珀酰辅酶A + CO₂ + NADH

该反应分三个步骤进行：α-酮戊二酸脱羧，NAD+还原为NADH，以及随后转移至CoA，形成最终产物琥珀酰辅酶A。该反应的ΔG°'为-7.2 kcal mol-1。该氧化所需的能量保存在琥珀酰辅酶A的硫酯键形成中。

琥珀酰辅酶A合成酶

琥珀酰辅酶A合成酶（琥珀酸硫激酶）催化琥珀酰辅酶A形成琥珀酸和辅酶A，一个4碳代谢物。琥珀酰辅酶A合成酶催化柠檬酸循环中的一个可逆步骤，该步骤涉及GDP的底物水平磷酸化。

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  琥珀酰辅酶A
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  琥珀酸

琥珀酸脱氢酶

琥珀酸脱氢酶或琥珀酸-辅酶Q还原酶（SQR）或复合物II是一种酶复合物，与哺乳动物线粒体和许多细菌细胞的线粒体内膜结合。它是唯一参与柠檬酸循环和电子传递链的酶。

在柠檬酸循环的步骤8中，SQR催化琥珀酸氧化为延胡索酸，同时将泛醌还原为泛醇。这在线粒体内膜中通过将这两个反应耦合在一起来实现。

延胡索酸酶

延胡索酸酶（或延胡索酸水合酶）是一种催化延胡索酸可逆水合/脱水为S-苹果酸的酶。延胡索酸酶有两种形式：线粒体和胞质。线粒体同工酶参与克雷布斯循环（也称为柠檬酸循环），而胞质同工酶参与氨基酸和延胡索酸的代谢。亚细胞定位是通过线粒体形式中的氨基末端存在信号序列而确定的，而胞质形式中的亚细胞定位是通过线粒体形式中发现的信号序列的缺失而确定的。这种酶还参与其他两个代谢途径：还原性羧化循环（CO2固定）以及肾细胞癌。

苹果酸脱氢酶

苹果酸脱氢酶（EC 1.1.1.37）（MDH）是柠檬酸循环中的一种酶，催化苹果酸转化为草酰乙酸（使用NAD+）反之亦然（这是一个可逆反应）。苹果酸脱氢酶不要与苹果酸酶混淆，苹果酸酶催化苹果酸转化为丙酮酸，产生NADPH。苹果酸脱氢酶也参与糖异生，即从较小的分子合成葡萄糖。线粒体中的丙酮酸受丙酮酸羧化酶作用形成草酰乙酸，它是柠檬酸循环的中间体。为了将草酰乙酸从线粒体中带出，苹果酸脱氢酶将其还原为苹果酸，然后穿过线粒体内膜。进入胞质后，苹果酸被胞质苹果酸脱氢酶氧化回草酰乙酸。最后，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）将草酰乙酸转化为磷酸烯醇丙酮酸。

克雷布斯循环或柠檬酸循环途径的步骤

两个碳原子被氧化为CO₂，这些反应的能量通过GTP（或ATP）以及NADH和QH₂中的电子转移到其他代谢过程。TCA循环中产生的NADH可能会在氧化磷酸化中将电子传递给驱动ATP合成的过程；FADH₂共价连接到琥珀酸脱氢酶，这种酶既在TCA循环中起作用，又在氧化磷酸化中的线粒体电子传递链中起作用。因此，FADH₂促进电子传递到辅酶Q，它是琥珀酸：泛醌氧化还原酶复合物催化的反应的最终电子受体，同时也作为电子传递链中的中间体。

柠檬酸循环不断通过乙酰辅酶A的形式补充新的碳，它从下面的步骤1开始进入。

	底物	产物	酶	反应类型	评论
1	草酰乙酸 + 乙酰辅酶A + H2O	柠檬酸 + CoA-SH	柠檬酸合酶	醛醇缩合	限速阶段（不可逆）， 将4C的草酰乙酸扩展为6C的分子
2	柠檬酸	顺式-乌头酸 + H2O	乌头酸酶	脱水	可逆异构化
3	顺式-乌头酸 + H2O	异柠檬酸		水合
4	异柠檬酸 + NAD+	草酰琥珀酸 + NADH + H +	异柠檬酸脱氢酶	氧化	产生NADH（相当于2.5个ATP）
5	草酰琥珀酸	α-酮戊二酸 + CO2		脱羧	不可逆阶段， 产生一个5C的分子
6	α-酮戊二酸 + NAD+ + CoA-SH	琥珀酰辅酶A + NADH + H+ + CO2	α-酮戊二酸脱氢酶	氧化 脱羧	不可逆阶段， 产生NADH（相当于2.5个ATP）， 再生4C链（不包括CoA）
7	琥珀酰辅酶A + GDP + Pi	琥珀酸 + CoA-SH + GTP	琥珀酰辅酶A合成酶	底物水平磷酸化	或ADP→ATP 而不是GDP→GTP， 产生1个ATP或其等价物
8	琥珀酸 + 泛醌（Q）	延胡索酸 + 泛醇（QH2）	琥珀酸脱氢酶	氧化	使用FAD作为辅基（反应第一步中FAD→FADH2）在酶中， 产生相当于1.5个ATP的能量
9	延胡索酸 + H2O	L-苹果酸	延胡索酸酶	H2O加成 （水合）
10	L-苹果酸 + NAD+	草酰乙酸 + NADH + H+	苹果酸脱氢酶	氧化	可逆（实际上，平衡有利于苹果酸），产生NADH（相当于2.5个ATP）

包括人类在内的动物的线粒体含有两种琥珀酰辅酶A合成酶：一种从GDP产生GTP，另一种从ADP产生ATP。 植物有产生ATP（ADP形成的琥珀酰辅酶A合成酶）的类型。循环中的几种酶可能松散地结合在线粒体基质内的多酶蛋白复合物中。

由GDP形成的琥珀酰辅酶A合成酶形成的GTP可被核苷二磷酸激酶利用形成ATP（催化的反应是GTP + ADP → GDP + ATP）。