生物化学原理/核酸 I：DNA 及其核苷酸

DNA 是一种由称为核苷酸的重复单元组成的长聚合物。正如詹姆斯·D·沃森和弗朗西斯·克里克首次发现的那样，所有物种的 DNA 结构都包含两条螺旋链，每条螺旋链都围绕同一个轴盘绕，每条螺旋链的螺距为 34 埃 (3.4 纳米)，半径为 10 埃 (1.0 纳米)。根据另一项研究，当在特定溶液中测量时，DNA 链的宽度为 22 到 26 埃 (2.2 到 2.6 纳米)，一个核苷酸单元的长度为 3.3 埃 (0.33 纳米)。虽然每个重复单元都很小，但 DNA 聚合物可以是包含数百万个核苷酸的超大分子。例如，人类最大的染色体，1 号染色体，大约有 2.2 亿个碱基对长。在生物体中，DNA 通常不以单分子的形式存在，而是以一对紧紧结合在一起的分子形式存在。这两条长链像藤蔓一样缠绕在一起，形成双螺旋的形状。核苷酸重复序列包含构成分子骨架的部分，该部分将链连接在一起，以及一个碱基，该碱基与螺旋中另一条 DNA 链相互作用。与糖连接的碱基称为核苷，而与糖和一个或多个磷酸基团连接的碱基称为核苷酸。如果多个核苷酸连接在一起，就像在 DNA 中一样，这种聚合物称为多核苷酸。DNA 链的骨架由交替的磷酸和糖残基构成。DNA 中的糖是 2-脱氧核糖，这是一种戊糖（五碳）糖。糖通过形成相邻糖环的第三和第五个碳原子之间的磷酸二酯键的磷酸基团连接在一起。这些不对称键意味着 DNA 链有一个方向。在双螺旋中，一条链中核苷酸的方向与另一条链中核苷酸的方向相反：链是反平行的。DNA 链的不对称末端称为 5'（5 质子）和 3'（3 质子）末端，其中 5' 末端具有末端磷酸基团，而 3' 末端具有末端羟基基团。DNA 和 RNA 之间的一个主要区别在于糖，DNA 中的 2-脱氧核糖被 RNA 中的另一种戊糖核糖取代。

DNA 双螺旋结构主要由两种力量稳定：核苷酸之间的氢键和芳香族碱基之间的碱基堆积相互作用。在细胞的水环境中，核苷酸碱基的共轭 π 键垂直于 DNA 分子的轴线排列，最大限度地减少了它们与溶剂化壳层的相互作用，从而最大限度地减少了吉布斯自由能。DNA 中发现的四种碱基是腺嘌呤（缩写为 A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T）。这四种碱基与糖/磷酸基团连接形成完整的核苷酸，如腺嘌呤单磷酸所示。这些碱基分为两类；腺嘌呤和鸟嘌呤是融合的五元和六元杂环化合物，称为嘌呤，而胞嘧啶和胸腺嘧啶是六元环，称为嘧啶。第五种嘧啶碱基，称为尿嘧啶（U），通常在 RNA 中代替胸腺嘧啶，它与胸腺嘧啶的不同之处在于其环上缺少一个甲基。尿嘧啶通常不存在于 DNA 中，仅作为胞嘧啶的分解产物出现。除了 RNA 和 DNA 之外，还创建了许多人工核酸类似物，用于研究核酸的性质或用于生物技术。

DNA 双螺旋结构。结构中的原子按元素颜色编码，两条链的螺旋骨架以橙色显示，两对碱基的详细结构在右下角显示。

DNA 是一种遗传物质

格里菲斯实验发现了肺炎球菌中的“转化因子”。

格里菲斯实验

格里菲斯实验由弗雷德里克·格里菲斯于 1928 年进行，是首批表明细菌能够通过称为转化的过程转移遗传信息。格里菲斯使用了两种能够感染小鼠的肺炎链球菌菌株——III-S 型（光滑型）和 II-R 型（粗糙型）菌株。III-S 型菌株用多糖荚膜包裹自身，该荚膜保护它免受宿主的免疫系统攻击，导致宿主死亡，而 II-R 型菌株没有这种保护性荚膜，被宿主的免疫系统击败。德国细菌学家弗雷德·诺伊费尔德发现了三种肺炎球菌类型（I 型、II 型和 III 型），并发现了 Quellung 反应，以便在体外识别它们。在格里菲斯实验之前，细菌学家认为这些类型是固定的，从一代到下一代不可改变。在这个实验中，III-S 型菌株中的细菌被热杀死，它们的残骸被添加到 II-R 型菌株细菌中。虽然单独两者都不会伤害小鼠，但它们的组合却能够杀死其宿主。格里菲斯还能够从小鼠的血液中分离出活的 II-R 型和活的 III-S 型肺炎球菌。格里菲斯得出结论，II-R 型被来自已死 III-S 型菌株细菌的某种“转化因子”转化成了致命的 III-S 型菌株。今天，我们知道格里菲斯观察到的“转化因子”是 III-S 型菌株细菌的 DNA。虽然细菌被杀死了，但 DNA 却在加热过程中存活了下来，并被 II-R 型菌株细菌吸收。III-S 型菌株 DNA 包含形成保护性多糖荚膜的基因。由于拥有了这个基因，以前属于 II-R 型的细菌现在可以免受宿主免疫系统的攻击，并且可以杀死宿主。转化因子的确切性质（DNA）在艾弗里、麦克劳德和麦卡锡以及赫尔希和蔡斯进行的实验中得到了验证。}}

赫尔希-蔡斯实验

阿尔弗雷德·赫尔希和玛莎·蔡斯在 1952 年进行了一系列实验，证实 DNA 是遗传物质，这在 1944 年的艾弗里-麦克劳德-麦卡锡实验中首次得到证明。这些实验被称为赫尔希-蔡斯实验。生物学家从 1869 年起就知道 DNA 的存在，但他们中的大多数人当时认为蛋白质承载着遗传信息。赫尔希和蔡斯在 T2噬菌体上进行了他们的实验。噬菌体由一个包含其遗传物质的蛋白质外壳组成。噬菌体通过附着在细菌的外膜上并注入其遗传物质来感染细菌，留下其空壳附着在细菌上。

在他们的第一组实验中，赫尔希和蔡斯用放射性磷-32 (p32) 对噬菌体的 DNA 进行了标记（磷元素存在于 DNA 中，但不存在于构成蛋白质的 20 种氨基酸中的任何一种）。他们让噬菌体感染大肠杆菌，并通过一些巧妙的实验，他们能够观察到标记有 P32 的噬菌体 DNA 转移到细菌的细胞质中。在他们的第二组实验中，他们用放射性硫-35 对噬菌体进行了标记（硫存在于氨基酸半胱氨酸和蛋氨酸中，但不存在于 DNA 中）。在感染大肠杆菌后，他们使用高速搅拌器将病毒蛋白外壳从感染的细胞上剪断，并使用离心机分离细胞和病毒外壳。分离后，在蛋白质外壳中观察到放射性 S35 示踪剂，但在感染的细菌中没有观察到，这支持了以下假设：感染细菌的遗传物质是 DNA 而不是蛋白质。 赫尔希因其“关于病毒遗传结构的发现”而分享了 1969 年的诺贝尔生理学或医学奖。

奥斯瓦尔德·T·艾弗里、科林·麦克莱德、麦克林·麦卡锡以及弗朗西斯·克里克和詹姆斯·D·沃森

核酸碱基

一个GC碱基对，展示了三个分子间氢键。

一个AT碱基对，展示了两个分子间氢键。

两条螺旋链形成DNA骨架。通过追踪链之间的间隙或凹槽，可以找到另一条双螺旋。这些空隙与碱基对相邻，可以提供一个结合位点。由于链不是直接相对的，因此凹槽的大小不一。一个凹槽，主沟，宽度为 22 Å，另一个，小沟，宽度为 12 Å。小沟的狭窄意味着碱基的边缘在主沟中更容易接近。因此，像转录因子这样的蛋白质可以结合到双链DNA中的特定序列中，通常与主沟中暴露的碱基侧面形成接触。这种情况在细胞内DNA的异常构象中有所不同，但主沟和小沟的命名始终反映了如果DNA被扭回到普通的B形式，将会看到的尺寸差异。。

DNA的碱基配对

DNA的结构。

查伽夫规则由埃尔温·查伽夫提出，该规则指出，所有生物体任何细胞的DNA都应该具有嘧啶和嘌呤碱基的 1:1 比例，更具体地说，鸟嘌呤的量等于胞嘧啶，腺嘌呤的量等于胸腺嘧啶。这种模式在DNA的两条链中都可以找到。它们是由奥地利化学家埃尔温·查伽夫发现的。

在分子生物学中，通过氢键连接在互补的DNA链上的两个核苷酸被称为碱基对（通常缩写为bp）。在规范的沃森-克里克DNA碱基配对中，腺嘌呤 (A) 与胸腺嘧啶 (T) 形成碱基对，鸟嘌呤 (G) 与胞嘧啶 (C) 形成碱基对。在RNA中，胸腺嘧啶被尿嘧啶 (U) 取代。其他氢键模式，如摆动碱基对和胡斯根碱基对，也会出现——特别是在RNA中——从而产生复杂的功能性三级结构。

例子

 5'CTCGTTTGCGCTCTATCG3'
 3'GAGCAAACGCGAGATAGC5'

嘌呤碱基

1884年，德国化学家埃米尔·费歇尔给“嘌呤”命名（purum uricum）。他于1899年首次从尿酸中合成它，尿酸是由谢勒于1776年从肾结石中分离出来的。除了DNA和RNA之外，嘌呤也是许多其他重要生物分子中的成分，例如ATP、GTP、环AMP、NADH和辅酶A。嘌呤本身在自然界中没有被发现，但它可以通过有机合成来制备。嘌呤是一种杂环芳香族有机化合物，由一个嘧啶环与一个咪唑环稠合而成。

例子

腺嘌呤

腺嘌呤是形成核酸（DNA或RNA）核苷酸的两种嘌呤核碱基之一（另一种是鸟嘌呤）。在DNA中，腺嘌呤通过两个氢键与胸腺嘧啶结合，以帮助稳定核酸结构。腺嘌呤在连接到核糖时形成腺苷，一种核苷，在连接到脱氧核糖时形成脱氧腺苷。当三个磷酸基团添加到腺苷时，它形成腺苷三磷酸 (ATP)，一种核苷酸。

鸟嘌呤

鸟嘌呤与腺嘌呤和胞嘧啶一起存在于DNA和RNA中，而胸腺嘧啶通常只在DNA中看到，而尿嘧啶只在RNA中看到。在DNA中，鸟嘌呤与胞嘧啶配对。鸟嘌呤的化学式为C5H5N5O，是嘌呤的衍生物，由一个稠合的嘧啶-咪唑环体系组成，具有共轭双键。

鸟嘌呤有两种互变异构体形式，主要的酮式形式和稀有的烯醇式形式。它通过三个氢键与胞嘧啶结合。在胞嘧啶中，氨基作为氢供体，C-2羰基和N-3胺作为氢键受体。鸟嘌呤在C-6处有一个基团作为氢受体，而N-1处的基团和C-2处的氨基作为氢供体。

嘧啶碱基

胸腺嘧啶的化学结构

胞嘧啶，带编号的组成部分。甲基化发生在第 5 个碳上。

尿嘧啶的化学结构

嘧啶是一种杂环芳香族有机化合物，类似于苯和吡啶，在六元环的第 1 位和第 3 位包含两个氮原子。它与二嗪的另外两种形式是异构体。核酸中发现的三个核碱基，胞嘧啶 (C)、胸腺嘧啶 (T) 和尿嘧啶 (U)，是嘧啶衍生物。

嘧啶与吡啶有很多共同的性质，随着环中氮原子数量的增加，环π电子变得不那么活跃和亲电，亲电芳香族取代变得更加困难，而亲核芳香族取代变得更容易。最后一个反应类型的例子是2-氨基嘧啶中氨基被氯取代及其逆反应。嘧啶的共振稳定性降低可能导致加成和开环反应而不是取代反应。在迪姆罗斯重排中观察到这种表现。与吡啶相比，N-烷基化和N-氧化更加困难，嘧啶的碱性也更低：质子化的嘧啶的pKa值为1.23，而吡啶的pKa值为5.30。 嘧啶也存在于陨石中，但科学家仍然不知道它的起源。嘧啶在紫外光下也能光解成尿嘧啶。

胞嘧啶的化学结构

胞嘧啶

胞嘧啶可以作为DNA的一部分、RNA的一部分或核苷酸的一部分被发现。作为胞苷三磷酸 (CTP)，它可以作为酶的辅因子，并且可以转移一个磷酸基团将二磷酸腺苷 (ADP) 转换为三磷酸腺苷 (ATP)。胞嘧啶的核苷是胞苷。在DNA和RNA中，胞嘧啶与鸟嘌呤配对。然而，它本质上是不稳定的，并且可以变成尿嘧啶（自发脱氨）。如果未被DNA修复酶（如尿嘧啶糖基化酶）修复，这会导致点突变，尿嘧啶糖基化酶可以切割DNA中的尿嘧啶。

胞嘧啶也可以被一种叫做DNA甲基转移酶的酶甲基化为5-甲基胞嘧啶，或者被甲基化和羟基化以制备5-羟甲基胞嘧啶。胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶的活性酶促脱氨作用，由APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶完成，可能对各种细胞过程以及有机体进化产生有益和有害的影响。另一方面，脱氨作用对5-羟甲基胞嘧啶的影响尚不清楚。

胸腺嘧啶

胸腺嘧啶 (T, Thy) 是DNA核酸中四种核碱基之一，用字母 G-C-A-T 表示。其他三种是腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶。胸腺嘧啶也称为5-甲基尿嘧啶，是一种嘧啶核碱基。顾名思义，胸腺嘧啶可以通过在第 5 个碳上甲基化尿嘧啶而获得。在RNA中，胸腺嘧啶在大多数情况下被尿嘧啶取代。在DNA中，胸腺嘧啶 (T) 通过两个氢键与腺嘌呤 (A) 结合，从而稳定核酸结构。

尿嘧啶

尿嘧啶存在于RNA中，它与腺嘌呤配对，并在DNA转录过程中取代胸腺嘧啶。尿嘧啶的甲基化会产生胸腺嘧啶。它变成胸腺嘧啶是为了保护DNA并提高DNA复制效率。尿嘧啶可以与任何碱基配对，具体取决于它在螺旋上的排列方式，但很容易与腺嘌呤配对，因为甲基被排斥到固定位置。尿嘧啶通过氢键与腺嘌呤配对。尿嘧啶是氢键受体，可以形成两个氢键。尿嘧啶也可以与核糖结合形成核糖核苷尿苷。当磷酸基团连接到尿苷时，就会产生尿苷 5'-单磷酸。

核苷和核苷酸

核苷酸

含氮碱基	核苷	脱氧核苷
w:腺嘌呤	w:腺苷 A	w:脱氧腺苷 dA
w:鸟嘌呤	w:鸟苷 G	w:脱氧鸟苷 dG
w:胸腺嘧啶	w:5-甲基尿苷 m5U	w:胸腺嘧啶核苷 dT
w:尿嘧啶	w:尿苷 U	w:脱氧尿苷 dU
w:胞嘧啶	w:胞苷 C	w:脱氧胞苷 dC

核苷是糖基胺，由一个核碱基（通常简称为碱基）通过β-糖苷键连接到一个核糖或脱氧核糖糖上。核苷的例子包括胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、胸腺嘧啶核苷和肌苷。核苷可以在细胞中被特定的激酶磷酸化，在糖的伯醇基（-CH2-OH）上产生核苷酸，核苷酸是 DNA 和 RNA 的分子构建块。

核苷可以通过从头合成途径产生，特别是在肝脏中，但它们更多地是通过摄入和消化饮食中的核酸而提供的，其中核苷酸酶将核苷酸（如胸腺嘧啶核苷酸）分解成核苷（如胸腺嘧啶核苷）和磷酸。

1. 腺苷是一种核苷，由一个腺嘌呤分子通过β-N9-糖苷键连接到一个核糖糖分子（核糖呋喃糖）部分。

2. 胞苷是一种核苷分子，当胞嘧啶通过β-N1-糖苷键连接到一个核糖环（也称为核糖呋喃糖）时形成。胞苷是 RNA 的组成部分。

3. 鸟苷是一种嘌呤核苷，由鸟嘌呤通过β-N9-糖苷键连接到一个核糖（核糖呋喃糖）环上。鸟苷可以磷酸化成为单磷酸鸟苷 (GMP)、环状单磷酸鸟苷 (cGMP)、二磷酸鸟苷 (GDP) 和三磷酸鸟苷 (GTP)。

4. 胸腺嘧啶核苷（更准确地说称为脱氧胸腺嘧啶核苷；也可以标记为脱氧核糖基胸腺嘧啶和胸腺嘧啶脱氧核苷）是一种化学化合物，更准确地说是一种嘧啶脱氧核苷。脱氧胸腺嘧啶核苷是 DNA 核苷 T，它在双链 DNA 中与脱氧腺苷 (A) 配对。

如果胞嘧啶连接到一个脱氧核糖环上，它被称为脱氧胞苷。

核苷酸

最常见的核苷酸的结构元素

一个核苷酸由一个核碱基（含氮碱基）、一个五碳糖（核糖或 2'-脱氧核糖）和一个到三个磷酸基组成。核碱基和糖一起构成了一个核苷。磷酸基团与糖的 2、3 或 5 碳形成键，其中 5 碳位点最常见。当磷酸基团与糖的两个羟基形成键时，就会形成环状核苷酸。核糖核苷酸是糖为核糖的核苷酸，脱氧核糖核苷酸包含糖脱氧核糖。核苷酸可以包含嘌呤或嘧啶碱基。核酸是由核苷酸单体组成的聚合的大分子。在 DNA 中，嘌呤碱基是腺嘌呤和鸟嘌呤，而嘧啶碱基是胸腺嘧啶和胞嘧啶。RNA 使用尿嘧啶代替胸腺嘧啶。腺嘌呤总是通过 2 个氢键与胸腺嘧啶配对，而鸟嘌呤通过 3 个氢键与胞嘧啶配对，每个配对都由于它们的独特结构。

脱氧核糖核苷酸是 DNA 或脱氧核糖核酸的单体或单个单元。每个脱氧核糖核苷酸包含三个部分：一个含氮碱基、一个脱氧核糖糖和一个或多个磷酸基团。含氮碱基总是与脱氧核糖的 1' 碳键合，脱氧核糖的 2' 碳上存在一个质子而不是 -OH 基团，这与核糖不同。磷酸基团与糖的 5' 碳键合。当脱氧核糖核苷酸聚合形成 DNA 时，一个核苷酸的磷酸基团将与另一个核苷酸的 3' 碳键合，通过脱水合成形成磷酸二酯键。新核苷酸总是添加到最后一个核苷酸的 3' 碳上，因此合成总是从 5' 到 3'。

磷酸二酯键

磷酸二酯键是一组在磷酸基团和两个 5 碳环碳水化合物（戊糖）之间通过两个酯键形成的强共价键。磷酸二酯键对地球上大多数生命至关重要，因为它们构成了 DNA 链的骨架。在 DNA 和 RNA 中，磷酸二酯键是连接一个糖分子的 3' 碳原子和另一个糖分子的 5' 碳原子的连接，DNA 中是脱氧核糖，RNA 中是核糖。磷酸二酯键中的磷酸基团带负电荷。由于磷酸基团的 pKa 接近 0，因此它们在 pH 7 时带负电荷。这种排斥力迫使磷酸盐占据 DNA 链的相反侧，并通过蛋白质（组蛋白）、金属离子（如镁）和多胺来中和。为了形成磷酸二酯键并连接核苷酸，需要将核苷酸构建块的三磷酸或二磷酸形式分解以释放催化酶催化反应所需的能量。当单个磷酸或两个称为焦磷酸的磷酸分解并催化反应时，就会形成磷酸二酯键。磷酸二酯键的水解可以被磷酸二酯酶的作用催化，磷酸二酯酶在修复 DNA 序列中起着重要作用。在生物系统中，两个核糖核苷酸之间的磷酸二酯键可以被碱性水解断裂，因为存在游离的 2' 羟基。

核苷酸之间磷酸二酯键 (PO₄^3-) 的示意图。显示了胸腺嘧啶 (U) 和两个腺嘌呤 (A) 分子。

w:单磷酸腺苷 AMP	w:二磷酸腺苷 ADP	w:三磷酸腺苷 ATP
w:单磷酸鸟苷 GMP	w:二磷酸鸟苷 GDP	w:三磷酸鸟苷 GTP
w:单磷酸核糖胸腺嘧啶 rTMP	w:二磷酸核糖胸腺嘧啶 rTDP	w:三磷酸核糖胸腺嘧啶 rTTP
w:单磷酸尿苷 UMP	w:二磷酸尿苷 UDP	w:三磷酸尿苷 UTP
w:单磷酸胞苷 CMP	w:二磷酸胞苷 CDP	w:三磷酸胞苷 CTP

使用分子模型和 DNA X 射线图案确定 DNA 结构

左图显示了通过 X 射线晶体学确定 DNA 结构的主要步骤，突出了 DNA 结构的分子模型在这个迭代过程中所起的关键作用。右图是通过定向和水合 DNA 纤维获得的 A 型和 B 型 DNA X 射线图案的图像（由 Herbert R. Wilson 博士提供，FRS）。

在使用标准生化技术分离和纯化 DNA 后，人们会在一个罐子里得到一个样本，就像本文顶部的图中一样。以下是使用分子模型，结合晶体学和 X 射线图案的数学分析，从定向 DNA 纤维的 X 射线衍射研究中生成结构信息的主要步骤，这些纤维是从水合 DNA 样本中提取的。

B 型 DNA 结构的近晶格模型

二氧化硅玻璃是另一种组织成近晶格的材料。

近晶格或近晶体是一种分子或原子晶格，其中分子排列存在相当数量（例如，大于百分之几）的部分无序。近晶体模型的极限情况是纳米结构，例如玻璃、液体等，它们可能只有局部有序，没有全局有序。以下图显示了二氧化硅玻璃的近晶格模型的简单示例。

液晶也具有近晶体结构而不是晶体结构。

高水化的 B-DNA 天然存在于活细胞中，处于一种准晶态，尽管相对刚性的 DNA 双螺旋结构通过两条互补的螺旋 DNA 链中核苷酸碱基对之间的平行氢键稳定（见图），但它仍是一个动态状态。为简单起见，大多数 DNA 分子模型省略了动态结合到 B-DNA 的水和离子，因此对理解 B-DNA 在体内动态行为不太有用。因此，准晶态 B-DNA 的 X 射线和光谱数据的物理和数学分析比晶态 A-DNA 的 X 射线衍射图复杂得多。准晶模型对于 DNA 技术应用也很重要，例如DNA 纳米技术。现在，也正在开发将 DNA 的 X 射线衍射与水化活细胞的 X 射线显微镜相结合的新技术。

DNA 的形式

A-DNA：A-DNA 是 DNA 的许多可能双螺旋结构之一。A-DNA 被认为是三种具有生物活性的双螺旋结构之一，另外两种是 B-DNA 和 Z-DNA。它是一种右手双螺旋，与更常见且众所周知的 B-DNA 形式非常相似，但具有更短、更紧凑的螺旋结构。它似乎只出现在脱水的 DNA 样本中，例如用于晶体学实验的样本，并且可能也被 DNA-RNA 杂交螺旋和双链 RNA 的某些区域所采用。

B-DNADNA 最常见的形式是 B-DNA。DNA 双螺旋是核酸的螺旋聚合物，由核苷酸连接在一起，核苷酸彼此配对。在 B-DNA 中，最常见的双螺旋结构，双螺旋是右手螺旋，每圈大约有 10-10.5 个核苷酸。DNA 的双螺旋结构包含一个主沟和一个次沟，主沟比次沟更宽。鉴于主沟和次沟宽度的差异，许多与 DNA 结合的蛋白质通过较宽的主沟结合。碱基或碱基对步的几何形状可以用 6 个坐标来表征：位移、滑动、上升、倾斜、滚动和扭曲。这些值精确地定义了核酸分子中每个碱基或碱基对相对于其沿螺旋轴的前体的空间位置和方向。它们共同表征了分子的螺旋结构。在 DNA 或 RNA 的结构发生“正常”结构破坏的区域，这些值的改变可用于描述这种破坏。对于每个碱基对，相对于其前体，有以下碱基对几何形状需要考虑

剪切：碱基看起来像是在 xy 平面上彼此移动。

拉伸：两个碱基在水平方向上被拉开。

交错：碱基在 xy 平面上既彼此移动又拉开。

弯曲：不接触的碱基末端向 z 轴向上倾斜。

螺旋扭曲：一个碱基相对于同一碱基对中的另一个碱基的旋转。

打开：碱基在一侧接触，但在另一侧彼此倾斜。

位移：沿碱基对平面中垂直于第一个的轴的位移，从次沟指向主沟。

滑动：沿碱基对平面中从一条链指向另一条链的轴的位移。

上升：沿螺旋轴的位移。

倾斜：绕此轴的旋转。

滚动：绕此轴的旋转。

扭曲：绕螺旋轴的旋转。

x 位移

y 位移

倾斜度

螺距：每圈螺旋的碱基对数量。

不同的碱基参数

上升和扭曲决定了螺旋的旋向和螺距。相比之下，其他坐标可以为零。滑动和位移在 B-DNA 中通常很小，但在 A-DNA 和 Z-DNA 中很大。滚动和倾斜使连续的碱基对不太平行，并且通常很小。这些坐标的图可以在 3DNA 网站上找到。请注意，“倾斜”在科学文献中经常被不同地使用，指的是第一个链间碱基对轴与螺旋轴垂直度的偏差。这对应于连续碱基对之间的滑动，在基于螺旋的坐标中，它被正确地称为“倾斜度”。

TA-DNA：TA-DNA 是一种 DNA 形式，在结构方面与 A-DNA 最密切相关。TA-DNA 螺旋是右手螺旋，与 A-DNA 一样，并且它两种形式之间最明显的区别是 TA-DNA 的碱基对倾斜度更大，相对于螺旋轴的角度约为 50 度。因此，TA-DNA 有时被称为倾斜的 A-DNA。

Z-DNA：Z-DNA 是 DNA 的许多可能双螺旋结构之一。它是一种左手双螺旋结构，其中双螺旋以之字形模式向左旋转（而不是像更常见的 B-DNA 形式那样向右旋转）。Z-DNA 被认为是三种具有生物活性的双螺旋结构之一，另外两种是 A-DNA 和 B-DNA。Z-DNA 与右手形式完全不同。实际上，Z-DNA 通常与 B-DNA 进行比较，以说明主要差异。Z-DNA 螺旋是左手螺旋，并且具有每 2 个碱基对重复一次的结构。与 A-DNA 和 B-DNA 不同，主沟和次沟的宽度差异很小。这种结构的形成通常是不利的，尽管某些条件可以促进它；例如交替的嘌呤-嘧啶序列（尤其是 poly(dGC)2）、负 DNA 超螺旋或高盐和一些阳离子（所有这些都在生理温度 37°C 和 pH 7.3-7.4 时）。Z-DNA 可以与 B-DNA 形成一个连接（称为“B-to-Z 连接盒”），该结构涉及碱基对的挤出。Z-DNA 构象很难研究，因为它并不作为双螺旋的稳定特征存在。相反，它是一种瞬态结构，偶尔由生物活性诱导，然后迅速消失。

从左到右，A、B 和 Z DNA 的结构

三种主要形式的 DNA 之间的差异

	A-DNA	B-DNA	Z-DNA
螺旋方向	右手	右手	左手
直径	23 Å (2.3 nm)	20 Å (2.0 nm)	18 Å (1.8 nm)
重复单元	1 bp	1 bp	2 bp
旋转/bp	32.7°	35.9°	60°/2
bp/圈	11	10.5	12
bp 相对于轴的倾斜度	+19°	−1.2°	−9°
沿轴的上升/bp	2.3 Å (0.23 nm)	3.32 Å (0.332 nm)	3.8 Å (0.38 nm)
螺旋的螺距/圈	28.2 Å (2.82 nm)	33.2 Å (3.32 nm)	45.6 Å (4.56 nm)
平均螺旋扭曲	+18°	+16°	0°
糖苷键角	反式	反式	C：反式， G：顺式
糖的构象	C3'-内式	C2'-内式	C：C2'-内式， G：C2'-外式

bp-碱基对，nm-纳米米

DNA 的次沟和主沟：DNA 的次沟和主沟是其所属的 DNA 类型的特征。它们非常重要，因为它们不仅构成了 A-DNA、B-DNA 和 Z-DNA 的特征结构，而且它们的差异决定了这些 DNA 与各种蛋白质的相互作用。这些沟中的宽度、狭窄度、深度、浅度以及静电势都对决定 DNA 如何与某些蛋白质反应、它将与哪些蛋白质反应以及某些部位是否可能根本不反应起着重要作用。

三种主要形式的 DNA 的次沟和主沟之间的差异

	次沟	主沟
A-DNA	宽而浅，静电势相对较低	窄而深，静电势相对较高
B-DNA	窄而深，静电势相对较高	宽而浅，静电势相对较低
Z-DNA	窄而深，主链呈之字形弯曲	不清晰，碱基边缘形成凸面

从左到右，A、B 和 Z DNA 的整体结构

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A-DNA、B-DNA 和 Z-DNA 相对电荷的差异：对于所有形式的 DNA，整体结构都带负电荷，整体静电势为负。这主要是由于 DNA 的磷酸基团，由于它们带负电的氧原子，它们带有一个负电荷。然而，DNA 在其外部结构上既有正电荷又有负电荷。DNA 的整体结构上的电荷分散在 A-DNA、B-DNA 和 Z-DNA 之间有所不同。A-DNA 在整个结构中大多具有负静电势，但主要集中在主沟部位。除了主沟之外，它还在其其余结构中广泛地分布着中性静电势。最后，A-DNA 在其表面散布着稀疏的正电荷。B-DNA 在其整个外部结构中大多具有负静电势，主要集中在主沟和次沟中。它在其表面上稀疏地散布着一些带正电荷的表面积，并且主要分布在宽阔的主沟内。Z-DNA 的次沟带负电荷，主沟通常所在的模糊区域具有轻微的正电荷部位。总体而言，Z-DNA 在其整个结构中都带负电荷。A-DNA、B-DNA 和 Z-DNA 的结构带负电荷。

三种主要形式的 DNA 的静电势之间的差异

	A-DNA	B-DNA	Z-DNA
负势	在整个结构中大量存在，但主要集中在主沟	在整个结构中大量存在，并在主沟和次沟中均匀集中	在整个全局结构中广泛存在，并在小沟中含量最高
正电势	非常稀疏地散布在小沟中，几乎不在大沟中	非常稀疏地散布在整个全局结构中，主要在大沟中	比 A-DNA 或 B-DNA 更稀疏地分散，但位于小沟之外
中性电势	在整个结构中中等程度地存在，主要位于小沟中，但不在大沟中	在整个结构中中等程度地分散，但含量低于 A-DNA	在整个全局结构中中等程度地分散，除了小沟之外

从左到右，A、B 和 Z DNA 的全局结构及其静电势

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DNA 的螺旋结构

具有低缠绕度的环状 DNA 分子的超螺旋结构。请注意，为了清晰起见，省略了 DNA 双链体的螺旋性质。

具有约束末端的线性 DNA 分子的超螺旋结构。请注意，为了清晰起见，省略了 DNA 双链体的螺旋性质。

DNA 超螺旋对于所有细胞中 DNA 的包装至关重要。由于 DNA 的长度可以是细胞长度的数千倍，因此将这种遗传物质包装到细胞或细胞核中（真核生物）是一项艰巨的任务。DNA 的超螺旋减少了空间，并允许包装更多的 DNA。在原核生物中，由于环状染色体和相对较少的遗传物质，主要以纽结状超螺旋为主。在真核生物中，DNA 超螺旋存在于纽结状和螺旋状超螺旋的多个层面上，螺旋状超螺旋在压缩 DNA 方面最有效。螺旋状超螺旋通过组蛋白来实现，形成 10 纳米纤维。该纤维进一步盘绕成 30 纳米纤维，并在自身上进一步盘绕多次。在核分裂事件（如有丝分裂或减数分裂）期间，DNA 包装会大大增加，此时 DNA 必须被压缩并分离到子细胞中。凝聚素和粘连蛋白是染色体结构维持蛋白，有助于姐妹染色单体的凝聚和姐妹染色单体着丝粒的连接。这些 SMC 蛋白诱导正超螺旋。DNA/RNA 合成也需要超螺旋。由于 DNA 必须解开以进行 DNA/RNA 聚合酶作用，因此将产生超螺旋。聚合酶复合体前面的区域将被解开；这种应力将通过复合体前面的正超螺旋来补偿。在复合体后面，DNA 被重新盘绕，并且将存在补偿性负超螺旋。重要的是要注意，拓扑异构酶（如 DNA 旋转酶（II 型拓扑异构酶））在 DNA/RNA 合成过程中缓解部分应力方面发挥着作用。

NA 超螺旋可以通过连接数的变化来进行数值描述。连接数' Lk。连接数是超螺旋 DNA 最具描述性的性质。Lk_o，松弛（B 型）DNA 质粒/分子的匝数，通过将分子的总碱基对除以松弛的 bp/匝数来确定，具体取决于参考文献，为 10.4-10.5。

$Lk_{o}=bp/10.4$

Lk 仅仅是指单链在平面投影中穿过另一链的次数。DNA 的拓扑结构由下面的方程描述，其中连接数等效于 TW 的总和，TW 是双螺旋的匝数或圈数，而 Wr 是卷数或“缠绕度”。如果存在一个闭合的 DNA 分子，则 TW 和 Wr 的总和，或连接数，不会改变。但是，TW 和 Wr 可以发生互补变化，而不会改变它们的总和。

$Lk=Tw+Wr$

连接数的变化，ΔLk，是质粒/分子中的实际匝数 Lk 减去松弛质粒/分子 Lk_o 中的匝数。

$\Delta {Lk=Lk-Lk_{o}}$

如果 DNA 呈负超螺旋，则 ΔLk < 0。负超螺旋意味着 DNA 被欠缠绕。

与分子大小无关的标准表达方式是“特定连接差异”或“超螺旋密度”，用 σ 表示。σ 表示相对于松弛分子/质粒中的总匝数添加或去除的匝数，指示超螺旋的程度。

$\sigma =\Delta {Lk/Lk_{o}}$

与缠绕相关的吉布斯自由能由下面的方程给出

${\Delta G/N=10RT\sigma ^{2}}$

连接数是一个数值不变量，它描述了三维空间中两条闭合曲线的连接。直观地说，连接数代表每条曲线绕另一条曲线缠绕的次数。连接数始终为整数，但根据两条曲线的方向可以为正或负。由于超螺旋 DNA 的连接数 *L* 是两条链相互交织的次数（并且两条链都保持共价完整），*L* 不能改变。环状 DNA 双链体的参考状态（或参数）*L₀* 是其松弛状态。在这种状态下，其缠绕度 *W* = 0。由于 *L = T + W*，在松弛状态下 *T = L*。因此，如果我们有一个 400 bp 的松弛环状 DNA 双链体，则 *L ~ 40*（假设 B-DNA 每圈 ~10 bp）。那么 *T ~ 40*。

• 正超螺旋

  T = 0，W = 0，则 L = 0

  T = +3，W = 0，则 L = +3

  T = +2，W = +1，则 L = +3

• 负超螺旋

  T = 0，W = 0，则 L = 0

  T = -3，W = 0，则 L = -3

  T = -2，W = -1，则 L = -3

负超螺旋有利于 DNA 的局部解开，从而允许进行诸如转录、DNA 复制和重组等过程。负超螺旋也被认为有利于 B-DNA 和Z-DNA之间的转变，并调节参与基因调控的 DNA 结合蛋白的相互作用。

DNA 测序

RNA测序是最早的核苷酸测序方法之一。 RNA测序的一个重要里程碑是第一个完整基因和噬菌体MS2的完整基因组的测序，由Walter Fiers及其在根特大学（比利时根特）的同事在1972年至1976年间鉴定并发表。 在20世纪70年代初，Frederick Sanger在英国剑桥大学，以及Walter Gilbert和Allan Maxam在哈佛大学开发出快速DNA测序方法之前，人们采用了许多费力的方法。 例如，1973年，Gilbert和Maxam使用一种称为“游点分析”的方法报道了24个碱基对的序列。 Sanger及其同事在1975年开发的链终止法很快成为首选方法，因为它相对简单且可靠。

Maxam和Gilbert方法

1976年至1977年，Allan Maxam和Walter Gilbert开发了一种DNA测序方法，该方法基于DNA的化学修饰以及随后在特定碱基处的裂解。 尽管Maxam和Gilbert在Sanger和Coulson关于“正负”测序的开创性论文发表两年后才发表了他们的化学测序方法，但Maxam-Gilbert测序迅速变得更加流行，因为可以直接使用纯化的DNA，而最初的Sanger方法则要求每个读取起点都被克隆用于生产单链DNA。 然而，随着链终止法的改进（见下文），Maxam-Gilbert测序已经不受欢迎，因为它的技术复杂性使其无法在标准分子生物学试剂盒中使用，需要大量使用有害化学品，并且难以放大。 该方法需要在DNA的一个5'末端进行放射性标记（通常通过使用γ-32P ATP的激酶反应），并纯化待测序的DNA片段。 化学处理会在四个反应中的一个或两个中对四个核苷酸碱基中的很小一部分产生断裂（G、A+G、C、C+T）。 例如，嘌呤（A+G）使用甲酸进行脱嘌呤，鸟嘌呤（以及一定程度上的腺嘌呤）使用二甲基硫酸进行甲基化，嘧啶（C+T）使用联氨进行甲基化。 在联氨反应中添加盐（氯化钠）可以抑制胸腺嘧啶在仅C反应中的甲基化。 然后，修饰的DNA在修饰碱基的位置用热哌啶裂解。 修饰化学品的浓度控制在平均每个DNA分子引入一个修饰。 因此，产生了一系列标记片段，从放射性标记的末端到每个分子中第一个“切割”位点。 在变性丙烯酰胺凝胶中并排电泳四个反应中的片段，以进行尺寸分离。 为了可视化片段，将凝胶暴露于X射线片上进行放射自显影，产生一系列暗带，每个暗带对应于一个放射性标记的DNA片段，由此可以推断出序列。 该方法也称为“化学测序”，它导致了用于绘制DNA结合蛋白的DNA结合位点的甲基化干扰分析法。

双脱氧核苷酸链终止法

放射性标记的测序凝胶的一部分

由于链终止法（或以其开发者 Frederick Sanger 命名的 Sanger 方法）比 Maxam 和 Gilbert 的方法更有效，并且使用的有毒化学物质和放射性物质更少，因此它迅速成为首选方法。 Sanger 方法的关键原理是使用双脱氧核苷酸三磷酸 (ddNTPs) 作为 DNA 链终止剂。

经典的链终止法需要单链 DNA 模板、DNA 引物、DNA 聚合酶、正常的脱氧核苷酸磷酸 (dNTPs) 和修饰的核苷酸 (双脱氧核苷酸)。 这些 ddNTPs 也会被放射性标记或荧光标记，以便在自动测序仪中检测。 将 DNA 样品分成四个独立的测序反应，每个反应包含所有四种标准脱氧核苷酸 (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP) 以及 DNA 聚合酶。 在每个反应中只添加四种双脱氧核苷酸中的一种 (ddATP、ddGTP、ddCTP 或 ddTTP)，它们是链终止核苷酸，缺少形成两个核苷酸之间磷酸二酯键所需的 3'-羟基 (OH) 基团，因此终止了 DNA 链的延伸，并导致了不同长度的 DNA 片段。

新合成的标记 DNA 片段被热变性，并根据尺寸（分辨率仅为一个核苷酸）通过变性聚丙烯酰胺-尿素凝胶电泳分离，四个反应中的每一个都在四个独立的泳道 (泳道 A、T、G、C) 中运行；然后通过放射自显影或紫外光可视化 DNA 带，并且可以从 X 射线片或凝胶图像直接读取 DNA 序列。 在右侧的图像中，将 X 射线片暴露于凝胶中，暗带对应于不同长度的 DNA 片段。 泳道中的暗带表示在掺入双脱氧核苷酸 (ddATP、ddGTP、ddCTP 或 ddTTP) 后链终止导致的 DNA 片段。 然后使用四个泳道中不同带的相对位置从下到上读取 DNA 序列。

DNA 片段用放射性或荧光标记在引物 (1) 上，在新的 DNA 链上用标记的 dNTP，或用标记的 ddNTP。（点击展开）

链终止测序的技术变体包括使用含有放射性磷的核苷酸进行放射性标记，或使用在 5' 端用荧光染料标记的引物。 染料引物测序有利于在光学系统中读取，以便更快、更经济地分析和自动化。 由 Leroy Hood 及其同事 开发的荧光标记 ddNTPs 和引物为自动化的、高通量的 DNA 测序奠定了基础。

放射性测序的序列梯度与荧光峰的比较

链终止法极大地简化了 DNA 测序。 例如，市面上有链终止法试剂盒，其中包含测序所需的试剂，已经预先分装好，可以随时使用。 局限性包括引物与 DNA 的非特异性结合，影响 DNA 序列的准确读取，以及 DNA 二级结构影响序列的保真度。

染料终止子测序

毛细管电泳（点击展开）

染料终止子测序 使用链终止 ddNTPs 的标记，允许在一个反应中进行测序，而不是像标记引物法那样进行四个反应。 在染料终止子测序中，四种双脱氧核苷酸链终止剂中的每一种都用荧光染料标记，每种染料在不同的波长发射光。

由于其更高的效率和速度，染料终止子测序现在是自动化测序的主流方法。 其局限性包括由于染料标记的链终止剂掺入 DNA 片段的差异而导致的染料效应，导致在 色谱图 中的电子 DNA 序列轨迹出现峰高和峰形不均。 毛细管电泳（见左侧图）。

这个问题已经通过使用改进的 DNA 聚合酶酶系统和最小化掺入变异性的染料以及消除“染料斑点”的方法得到解决。 染料终止子测序方法以及自动化的、高通量的 DNA 序列分析仪现在正被用于绝大多数测序项目。

挑战

DNA 测序的常见挑战包括序列前 15-40 个碱基的质量较差，以及在 700-900 个碱基后的测序轨迹质量下降。 碱基识别 软件通常会给出质量估计，以帮助进行质量修剪。

在 DNA 片段在测序之前被克隆的情况下，所得序列可能包含克隆载体的部分。 相反，基于 PCR 的克隆和新兴的基于焦磷酸测序的测序技术通常避免使用克隆载体。 最近，开发出一种步法 Sanger 测序（结合扩增和测序）方法，例如 Ampliseq 和 SeqSharp，它们允许在不克隆或事先扩增的情况下快速测序目标基因。

当前方法只能在一个反应中直接测序相对较短的（300-1000 核苷酸 长）DNA 片段。 测序大于此尺寸限制的 DNA 片段的主要障碍是缺乏区分仅在长度上相差一个核苷酸的大型 DNA 片段的分离能力。 在所有情况下，使用具有游离 5' 末端的引物是必不可少的。

自动化和样本制备

示例染料终止子读取的开头视图

自动 DNA 测序仪 (DNA 测序仪) 可以在一次批次 (运行) 中对多达 384 个 DNA 样本进行测序，每天最多可以运行 24 次。DNA 测序仪进行毛细管电泳以进行大小分离、检测和记录染料荧光，并将数据输出为荧光峰迹色谱图。测序反应通过热循环、清理和重新悬浮在缓冲溶液中，然后装载到测序仪上，这些步骤是单独执行的。许多商业和非商业软件包可以自动修剪低质量的 DNA 迹线。这些程序会评估每个峰的质量并去除低质量的碱基峰（通常位于序列的末端）。此类算法的准确性低于人工操作员的目视检查，但足以自动处理大型序列数据集。

需要记住的事实

1. 1869 年，瑞士医生弗里德里希·米歇尔从丢弃的绷带脓液中首次分离出 DNA，他发现了一种显微镜下可见的物质。
2. 1937 年，威廉·阿斯特伯里制作了第一个 X 射线衍射图谱，表明 DNA 具有规则的结构。
3. 1928 年，弗雷德里克·格里菲斯发现，将杀死的“光滑型”肺炎球菌与活的“粗糙型”肺炎球菌混合，可以将“光滑型”的特征转移到“粗糙型”。
4. 1952 年，阿尔弗雷德·赫希和玛莎·蔡斯在赫希-蔡斯实验中表明，DNA 是 T2噬菌体的遗传物质。
5. 1953 年，詹姆斯·D·沃森和弗朗西斯·克里克提出了 DNA 结构的双螺旋模型。
6. 1972 年，重组 DNA 技术的开发，允许分离出明确的 DNA 片段；在此之前，唯一可用于测序的样本来自噬菌体或病毒 DNA。
7. 1977 年，第一个完整的 DNA 基因组被测序，即噬菌体 φX174。
8. 1977 年，艾伦·马克萨姆和沃尔特·吉尔伯特发表了“化学降解法测序 DNA”。弗雷德里克·桑格独立发表了“用链终止抑制剂测序 DNA”。
9. 1984 年，英国医学研究委员会的科学家破译了艾伯斯坦-巴尔病毒（170 kb）的完整 DNA 序列。
10. 1986 年，加州理工学院勒罗伊·E·胡德的实验室和史密斯宣布了第一台半自动 DNA 测序仪。
11. 1987 年，应用生物系统公司推出了第一台自动化测序仪，型号为 ABI 370。
12. 1990 年，美国国立卫生研究院 (NIH) 开始对解螺旋支原体、大肠杆菌、秀丽隐杆线虫和酿酒酵母进行大规模测序试验（每碱基 0.75 美元）。
13. 1991 年，克雷格·文特尔的实验室开始对人类表达序列标签进行测序，试图捕获人类基因组的编码部分。
14. 1995 年，克雷格·文特尔、汉密尔顿·史密斯及其同事在基因组研究所 (TIGR) 发表了第一个自由生活生物体的完整基因组，即嗜血杆菌。这个环状染色体包含 1,830,137 个碱基，其发表在《科学》杂志上标志着首次使用全基因组鸟枪法测序，消除了对初始作图工作的需求。
15. 1996 年，帕尔·尼伦和他的学生穆斯塔法·罗纳吉在斯德哥尔摩的皇家理工学院发表了他们的焦磷酸测序方法。
16. 1998 年，华盛顿大学的菲尔·格林和布伦特·尤因发表了用于测序数据分析的“phred”。
17. 2000 年，Lynx Therapeutics 发布并推出了“MPSS”——一种并行、适配器/连接介导的、基于珠子的测序技术，开启了“下一代”测序。
18. 2001 年，人类基因组草图发表。
19. 2004 年，454 Life Sciences 推出了一种并行的焦磷酸测序版本。他们机器的第一版将测序成本降低了 6 倍，与自动桑格测序相比，这是继 MPSS 之后新一代测序技术中的第二种。