蛋白质组学/生物标志物
演示文稿
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主要重点
本文的主要重点是回顾了使用质谱定量蛋白质的方法和应用，特别是那些浓度低于 µg/ml 的蛋白质，试图使程序普遍化。
新术语
- MALDI TOF/TOF
- 基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱仪。
- 选择反应监测 (SRM)
- 一种方法，其中检测来自特定母离子的特定产物离子。所有其他质量不在预定范围内指定的离子都被滤除，只留下质量在我们要寻找的范围内的离子。（来源 http://en.wikipedia.org/wiki/Mass_chromatogram#Selected_reaction_monitoring_.28SRM.29）
- 三重四极杆
- 一种包含三个四极杆线性序列的 MS 类型。第一组和第三组充当质量过滤器，第二组是碰撞池。这种类型的 MS 可以“过滤”已知质量的离子。（来源 http://en.wikipedia.org/wiki/Quadrupole_mass_analyzer）
- 酰肼
- 一类有机化合物，它们共享一个共同的官能团，其特征在于 N-N 共价键，其中一个成分是酰基。（来源 http://en.wikipedia.org/wiki/Hydrazide）
- 生物标志物
- 可以用来衡量治疗或疾病影响进展的生化特征。（来源 http://www.medterms.com/script/main/art.asp?articlekey=6685）
对于本摘要，我们将重点关注蛋白质生物标志物。一些具有显示出作为筛选工具前景的蛋白质生物标志物的疾病是乳腺癌、阿尔茨海默病、白血病、ALS 和帕金森病[1]。为了成功验证一种或一组生物标志物，必须完成六个步骤：发现、鉴定、验证、测定优化、验证和商业化[2]。一旦找到并接受生物标志物，就可以将其用于预测和预防与之相关的疾病。以下摘要重点介绍了寻找和识别蛋白质生物标志物中蛋白质定量的方法。通过找到普遍定量蛋白质的方法，可以进行一次筛选而不是多次筛选来寻找所有生物标志物，一旦确定了结论性的生物标志物。
总结
随着技术的最新突破，可以想象，可以使用一种“通用”方法或方法，对大量的蛋白质进行定量分析，以寻找潜在的生物标志物，而几乎没有限制。一旦发现了几个潜在的生物标志物，就可以进行进一步的研究来确认或反驳其在临床应用中的使用。另一个目标是轻松地在一个测量中积累多个检测。通过识别合成稳定同位素连接到其相应的蛋白质或肽上，进行测量。每种同位素都模拟肽的内源性对应物，从而实现高选择性。
质谱 (MS) 为我们提供了一个强大的工具来比较两种不同的蛋白质样本。它可以用于在全球范围内比较患病样本与正常样本的蛋白质组。这适用于各种人类疾病，希望它能导致识别生物标志物甚至疾病的发病机制。传统上，ELISA（酶联免疫吸附测定）一直是具有良好灵敏度的蛋白质定量的主要方法。即使在今天，它仍然是靶向蛋白质定量的“金标准”。ELISA 的主要缺点是缺乏高特异性抗体。
大约 20 年前，使用稳定同位素稀释法和 MS 首次尝试确定特定蛋白质的量，从原子轰击 MS 和氘标记的合成多肽开始。MS 仪器的进步提高了我们在复杂生物样本中检测候选蛋白质的能力，并具有很高的灵敏度。为了量化结果，将稳定同位素（例如，含有13C 或15N）引入参考肽序列中的选定氨基酸，提供具有相同理化性质的肽，可以通过 MS 与靶组织或液体中的肽轻松区分。研究表明，含有稳定同位素的全长蛋白质可用于定量尿液和水样品中的生物标志物，灵敏度分别达到纳摩尔和皮摩尔水平。
用于定量蛋白质组学的多平台 MS 平台，其中一些是三重四极杆（三重 Q）、基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱仪 (MALDI TOF/TOF)、基于 QTOF MS 的电喷雾电离 (ESI) 和使用选择性离子监测 (SIM) 模式的离子阱仪器。上述平台中最受欢迎的是三重 Q。演示表明，它可以在单个测量中多路复用并同时靶向超过 50 种肽以进行血浆定量。对于靶向定量分析，液相色谱与 MALDI 的耦合极大地增强了 MALDI 基质 MS 的性能。这种应用的一些优势包括能够并行执行技术，可以将其制成高度选择性的数据驱动程序，并且在一定程度上保留样本以进行重复分析。该技术还以其潜在的高通量和出色的分辨率而著称。
定量中最重要的一步之一是样品制备，这会极大地影响灵敏度。最常用的步骤之一是去除高丰度蛋白，这使得增强分析动态范围和检测低浓度蛋白变得更加容易。执行的技术之一是强阳离子交换色谱 (SCX)，该技术已被证明能够检测到高 pg/ml 水平的肽，比直接血浆分析提高了 100 倍。
翻译后修饰 (PTM) 是一种重要的过程，需要理解，因为它通常参与肿瘤进展，但由于糖链的复杂性和结构（如糖基化 PTM），很难模拟。一项实验提取了 N-连接的糖肽并脱糖基化。这导致 Asn 转换为 Asp 以及质量的差异。利用这一点制作了合成多肽来复制其糖基化形式的 N-连接糖肽。
基于 MS 的定量的主要特点之一是用于识别与疾病相关的生物标志物的临床应用。例如，已经提出了 177 种与血浆中中风和心血管疾病相关的蛋白质候选者。一些与中风相关的生物标志物是 S-100b、B 型神经营养生长因子、冯·维勒布兰德因子和单核细胞趋化蛋白-1[3]。已经提出了其他生物标志物来识别类风湿性关节炎和乳腺癌等疾病。
定量蛋白质和肽能力的主要目标之一是用于个性化医疗。随着技术的进步，我们将能够创造出能够在单次测量中轻松组装多个检测的技术。来自疾病的生物标志物也可以在单次测定中进行多路复用，使我们有可能诊断多种疾病。理想情况下，单步制备策略是关键，可以实现高通量和可能实现自动化流程，减少人工干预的次数和人为错误的可能性。
与蛋白质组学课程的相关性
使用质谱定量蛋白质的能力是一个很好的工具，可以比较来自对照样品和测试样品的大量蛋白质，以寻找生物标志物。当检测到明显差异时，可以对这些蛋白质进行进一步研究。MS 技术的重大突破使我们能够普遍地采用定量广泛蛋白质谱的方法，几乎没有限制。它还使我们能够在每次测量中进行更多检测。在未来，这些方法可以为个性化医疗铺平道路，使我们能够通过检测来自单一或多种疾病的多种生物标志物来筛选个人。
参考文献
[1] 制药外包决策。SPG 媒体有限公司。 (http://www.pharmaceuticaloutsourcing.com/articles/pod003_014_power3.htm)
[2] Rifai，Nader，Gillette，Michael A. 和 Carr，Steven A. “蛋白质生物标志物发现和验证：通往临床实用性的漫长而不可预测的道路”。自然生物技术 24, 971 - 983 (2006) (http://www.nature.com/nbt/journal/v24/n8/abs/nbt1235.html)
[3] Reynolds，Mark A. 等人。“中风早期生物标志物”。临床化学 49 (2003)：1733-1739。印刷。(http://www.clinchem.org/cgi/content/abstract/49/10/1733)