蛋白质组学/实验方案/植物蛋白质组学关于二维凝胶电泳

二维凝胶电泳 1. 取4个试管，一侧用保鲜膜覆盖。 2. 制备吸管凝胶缓冲液。 3. 在加入两性电解质前，用手摇晃直到溶解。 4. 用注射器混合均匀。 5. 用注射器将吸管凝胶缓冲液注入玻璃管中。 6. 保持至少6小时。 7. 植物样品制备 • 取成熟种子。 • 倒入液氮。 • 用研钵和研杵研磨。 • 在使用前将裂解缓冲液加入样品中，裂解缓冲液在水浴中于1000℃加热3分钟。 • 将样品置于冰上，用Vibra Cells混合。 • 离心沉淀。 • 在70℃下离心20分钟。 • 取白蛋白和白蛋白标准品（DDW：Bradford = 4:1），即（8000 + 2000）µl。 • 准备2组样品和1组5 µl用于紫外分光光度计，另一组用于2-DE。 • 制备3个标准样品（5、10、15 µl）。 • 另一组置于水浴中于1000℃加热3分钟。 • 用紫外分光光度计测试浓度。 8. 准备小瓶，并在小瓶中加入10 ml样品缓冲液。 9. 检查凝胶并用注射器将其放入小瓶中。 10. 放入摇床中摇晃1小时30分钟。 11. 去除溶液，再次加入10 µl缓冲液两次。 12. 制备分离凝胶，倒入并等待40分钟。 13. 制备积层凝胶，并等待3-4小时。 14. 将机器运行到顶部（H3PO4）和底部（NaOH）。 15. 在去除水之前，将样品倒入试管中。 16. 启动机器（第一小时=200 V，第二小时=400 V，接下来的16小时=600 V）。

17. 将一维凝胶置于二维板上。 18. 制备琼脂糖凝胶。 19. 放置标记和琼脂糖凝胶。 20. 运行机器（一台机器80 mA，两台机器160 mA），直到结束。 21. 分离凝胶，在制备考马斯亮蓝之前将其浸泡在考马斯亮蓝中。 22. 保持至少12小时。

银染方案 1. 固定液 40% 乙醇

1. 乙醇 100 ml
2. 冰醋酸 25 ml
3. 水 250 ml

注意：将凝胶浸泡在固定液中30分钟。 2. 感光液

1. 乙醇 75 ml
2. 硫代硫酸钠（5% w/v）10 ml
3. 醋酸钠（17 g）1包
4. 水 250 ml

使用前：添加1.25 ml戊二醛（25% w/v） 注意：去除溶液。 加入感光液，摇晃至少30分钟。

1. 洗涤5分钟。

3. 银溶液

1. 硝酸银溶液（2.5% w/v）25 ml
2. 水 250 ml

使用前：添加0.1 ml甲醛（37% w/v） 注意：摇晃20分钟，洗涤1分钟，重复两次。 4. 显影液

1. 碳酸钠（6.25 g）1包
2. 水 250 ml
3. 剧烈搅拌以溶解碳酸钠。

注意：摇晃2-5分钟。 5. 终止液

1. EDTA-Na¬¬2 .2 H2 O (3.65 g) 1包
2. 水 250 ml

注意：摇晃10分钟，用双蒸水洗涤5分钟，重复三次。 6. 水溶液

1. 双蒸水

凝胶内消化

1. 在500 µl试管中加入200 µl DDW。 2. 用1 ml蓝色吸头将凝胶从凝胶板上分离。 切片凝胶，涡旋5分钟并去除水。 3. 加入100 µl 25mM ABC/50% ACN，然后涡旋10分钟，离心沉淀并去除溶液。 重复4-5次。

1. 1. 过度染色，直到变成白色，持续30分钟。

4. 放入真空浓缩仪中。 5. 加入50 µl mM DTT/25 mM，然后在水浴中于56℃加热45分钟，然后离心沉淀并去除溶液。 6. 加入50 µl mM IAA/0.1% ABC，并在黑暗处放置30分钟。 7. 不要离心沉淀，去除溶液。 8. 加入50 µl 0.1M ABC，涡旋5分钟并去除溶液。 9. 加入50 µl 100% ACN，涡旋15分钟并去除溶液。 10. 放入真空浓缩仪中30分钟。 11. 加入25 µl胰蛋白酶（0.1 µg/µl），在4℃冰箱中放置45分钟。 12. 加入35-40 µl 25mM ABC（pH 8.0），在水浴中于37℃孵育过夜，然后离心沉淀，提取胰蛋白酶。 13. 制备ACN/DDW/TFA (660:330:10) µl。 14. 在样品中加入50 µl (ACN/DDW/TFA)，放置30分钟并过度染色，重复此步骤，离心沉淀，提取溶液并保存。 重复此步骤。 15. 放入真空浓缩仪中2小时，直到样品体积为10-20 µl。

MALDI-TOF/MS 分光光度计

1. 在凝胶块中加入5%甲酸（考马斯亮蓝为10 µl，银染为5 µl），然后用移液器移取。 2. 涡旋并离心沉淀。 3. 制备溶液A：0.1% TFA，溶液B：70% ACN，0.03% TFA，基质溶液：（0.1% TFA 500µl + 50% ACN 500µl + CHCA 10 mg）。 4. 使用C18吸头，用溶液B：70% ACN，0.03% TFA冲洗Zip Tip（5-10次）。 5. 使用C18吸头，用溶液A：0.1% TFA冲洗Zip Tip（5-10次）。 6. 将样品在Zip Tip中上下移动（10次）。 7. 用溶液A：0.1% TFA脱盐。 8. 将基质溶液（5-10 µl）放置在MALDI板上。 9. 干燥后，加入溶液A：0.1% TFA并去除。 10. 加入DDW并去除。

提交者：Abu Hena Mostafa Kamal，博士生，植物蛋白质组学实验室，作物科学系，农业学院，忠北国立大学，清州，361-763，韩国