蛋白质组学/蛋白质分离- 电泳/二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)

2D-PAGE是一种凝胶电泳形式，其中样品中蛋白质的分离和鉴定是通过在两个相互垂直的维度（正交）上的位移来完成的。该技术也用于比较两个或多个样品，以找出其蛋白质表达的差异。

分离基础

在这种技术中，蛋白质通过两种不同的理化性质进行分离。在第一维中，蛋白质或多肽根据其净电荷通过等电聚焦进行分离，在第二维中，它们根据其分子量通过电泳进行分离。由于两种分子不太可能在两种性质上都相似，因此在二维电泳中，分子比一维电泳更有效地分离。

样品制备

样品制备的目的是使最大数量的蛋白质溶解并保持其在整个过程中的溶解性。样品的材料应仔细收集、速冻并在液氮中存在蛋白酶抑制剂的情况下研磨。从来源材料中提取蛋白质后，它们通过用致变剂、去垢剂和还原剂溶解和变性。尿素和硫脲是致变剂，用于破坏样品蛋白质中的氢键。非离子去垢剂用于破坏疏水相互作用。CHAPS、Triton X-100、磺基甜菜碱SB3-10和酰胺磺基甜菜碱是IEF兼容的添加剂。二硫键通过还原剂二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓醇和三丁基膦(TBP)还原为巯基。

顺序提取用于根据蛋白质的溶解性对蛋白质进行分类。这是预分馏以富集低丰度蛋白质的一个例子。蛋白质被顺序提取到溶解能力不断增加的致变剂/去垢剂溶液中。首先，蛋白质用含水缓冲液处理，从该提取中剩余的不可溶蛋白质用尿素/CHAPS/TBP处理，然后从该步骤中剩余的不可溶蛋白质用尿素/硫脲/CHAPS/SB 3-10/TBP处理。然后进行2D-PAGE以分离每个上清液中的蛋白质。从最后一步提取中剩余的不可溶物质可以吸收在SDS-PAGE样品溶液中，并在一维凝胶中运行。

等电聚焦(IEF)

在IEF中，蛋白质根据其等电点(pI)在pH梯度中通过电泳分离。在凝胶中产生pH梯度，并在凝胶上施加电势。在除了等电点以外的所有pH值下，蛋白质都带电。如果它们带正电，它们将移动到凝胶的负极端；如果它们带负电，它们将移动到凝胶的正极端。在其等电点，由于蛋白质分子不带净电荷，因此它会积累或聚焦成一个尖锐的带。

固定化pH梯度(IPG)和IEF运行

固定化pH梯度用于IEF，因为固定pH梯度在非常高的电压下在长时间运行中保持稳定。IPG的pH梯度是通过将缓冲化合物共价结合到聚丙烯酰胺凝胶中产生的。IPG是带有塑料支撑层的铸造条，可在不同的pH范围内和长度范围内商业化获得。它们提供高分辨率、高重现性，并允许高蛋白负载。等电聚焦在用于提取或溶解蛋白质的相同溶液中进行。带有蛋白质样品的IPG条必须在复水/样品缓冲液中复水，在复水过程中将蛋白质样品加载到条中。复水可以是主动的或被动的。为了加载更大的蛋白质，在低电压下施加主动复水。在IEF电池中运行后，蛋白质根据其等电点聚焦成条带。聚焦条可以冷冻保存。

SDS-PAGE

IPG凝胶条平衡

聚焦的IPG条中的蛋白质不带电，因为它们处于其pI，因此它们不会移动到SDS-PAGE凝胶中。因此，这些条用SDS（十二烷基硫酸钠）处理，SDS是一种阴离子去垢剂，通过破坏二硫键使蛋白质变性，并根据蛋白质的质量赋予每个蛋白质负电荷。如果没有SDS，具有相似分子量的不同蛋白质由于折叠的不同而会以不同的方式迁移，因为折叠模式的差异会导致一些蛋白质比其他蛋白质更好地通过凝胶基质。SDS线性化蛋白质，使它们可以严格地按分子量分离。SDS与蛋白质的结合比例大约为每1.0克蛋白质1.4克SDS（尽管结合比例可以从1.1-2.2克SDS/克蛋白质不等），这使得大多数蛋白质具有近似均匀的质量/电荷比，因此可以通过凝胶的迁移距离可以假定与蛋白质的大小直接相关。蛋白质可以进一步用还原剂处理，如二硫苏糖醇(DTT)或TRP(三丁基膦)以破坏任何重新形成的二硫键，然后用碘乙酰胺烷基化以防止二硫键的重新形成。可以将跟踪染料如溴酚蓝添加到蛋白质溶液中，以跟踪蛋白质溶液在电泳运行过程中通过凝胶的进程。

SDS-PAGE运行

平衡的IPG条被放置在SDS-PAGE凝胶顶部，浸没在合适的缓冲液中，并用琼脂糖凝胶固定到位。在凝胶上施加电流，导致带负电的蛋白质从凝胶中移出，并穿过凝胶迁移。根据蛋白质的大小，每种蛋白质都会以不同的方式穿过凝胶基质。较小的蛋白质会沿着凝胶迁移得更远，而较大的蛋白质会停留在更靠近起点的位置。蛋白质大致根据大小，因此根据分子量分离。通常，将已知分子量的“标记蛋白质”在凝胶中的单独泳道中运行，以便校准凝胶并通过比较相对于标记蛋白质的迁移距离来确定未知蛋白质的重量。

可视化

电泳后，凝胶会被染色以观察分离的蛋白质。常用的染色剂有考马斯亮蓝、SYPRO Ruby 或银染。不同的蛋白质会在凝胶中显示为不同的点。考马斯亮蓝或 SYPRO Ruby 与质谱法兼容。考马斯亮蓝的检测限约为每个点 10ng 蛋白质，而凝胶点的图像可以通过在可见光下工作的扫描密度计捕获 [[1]]。SYPRO Ruby 可以检测到每个点 1ng 蛋白质，由于它具有荧光性，因此可以通过荧光成像仪观察到点。银染可以检测到包含少于 1ng 蛋白质的点，是最灵敏的非放射性蛋白质可视化方法。用于图像捕获的激光设备适用于荧光染色凝胶。

分析

这些图像可以通过图像分析软件进行进一步分析。这些软件可以对蛋白质点进行量化、匹配图像并比较相关凝胶中对应点的强度、准备凝胶数据报告、去除背景模式，并将图像信息整合到数据库中。或者，可以从凝胶中获取分离的蛋白质，并通过质谱法进行蛋白质鉴定分析。二维电泳可用于研究差异蛋白质表达，方法是比较用稳定同位素或荧光染料标记的二维电泳凝胶样本的图像。

优点和缺点

使用二维电泳，可以在一次运行中分析 100 到 1000 多种多肽。蛋白质可以从点中分离出来，得到纯的形式。可以对点进行量化，也可以通过质谱法进行分析。在这种方法中，多肽可以被抗体探测，也可以检测其翻译后修饰。缺点可能包括大量样本处理、重现性差、难以分离低丰度蛋白质、酸性和碱性蛋白质、非常大或非常小的蛋白质以及疏水性蛋白质。此外，该方法无法实现高通量分析的自动化。二维电泳的动态范围有限。

参考文献

Beranova-Giorgianni, S. (2003) 利用二维凝胶电泳和质谱法进行蛋白质组分析：优势和局限性。TrAC 趋势分析化学 22(5), 273-281.[[2]]
Stephen J. Fey* 和 Peter Mose Larsen (2001) 二维还是非二维。化学生物学现状 2001, 5:26–33.[[3]]
Wayne F. Patton*，Birte Schulenberg 和 Thomas H Steinberg (2002) 二维凝胶电泳；比 ICAT 更好？生物技术现状，13:321–328.[[4]]
David E. Garfin (2003) 二维凝胶电泳：概述。趋势分析化学，第 22 卷，第 5 期
http://www.weihenstephan.de/blm/deg/manual/manualwork2html02test.htm
http://www.aber.ac.uk/parasitology/Proteome/Tut_2D.html