感觉系统/视觉系统/体内成像

胚胎皮层的超高分辨率钙成像。

艾伦研究院大数据

大脑中大约有1000亿个神经元。大脑内部的复杂性是无与伦比的。举个例子，当向被动小鼠展示变化的图像时，会出现兴奋性神经元、抑制性神经元、预测图像变化时活动增加的神经元，以及当预测的图像变化没有发生时活动持续累积的神经元。随着信息编码方案这种维度，必须在后续步骤中进行整合以形成我们完整的视觉感知，神经科学界的一个关键目标是产生大数据。为了成功地在非常大的规模上生成感觉处理的体内数据，艾伦脑科学研究所等机构在过去十年里专注于自动化数据生产和收集的流程。截至目前，艾伦研究院已经发布了大量来自视觉编码流程生成的数据，并且目前正在通过他们的视觉行为流程进行新的数据生产方法。

艾伦研究院是通过标准化程序生成大量感觉处理数据的成功成像策略实施的一个关键例子。艾伦研究院的流程包括七个步骤，工程师、光学技术员和外科技术员团队协作以确保其顺利运行。到目前为止，这种学科和思想的整合已经产生了1900种细胞类型的形态学、基因活动、电生理学、钙成像和拓扑学数据。所有数据都是使用尖端的成像技术收集的，这些技术使长期和高灵敏度的记录成为可能。

实验设置

在任何体内成像过程中实现高分辨率都需要一些独特的启发式方法。在进行任何成像之前，小鼠必须进行手术以植入头部固定架。在手术过程中，外科医生会移除一小部分颅骨，然后用一块附着在头部固定架上的玻璃颅窗覆盖（图 1）。头部固定架的目的是双重的：（1）它允许在成像步骤中观察荧光变化，以及（2）它可以钩在头部固定板上，确保头部固定并在成像过程中获得最高分辨率。由于这完全限制了头部并增加了压力的可能性，因此在小鼠下方放置了一个旋转盘，以允许缓解压力的跑步活动（图 2）。这种活动被监测并输入到数据输出中，作为研究人员进行额外分析的技术。记录的其他数据测量包括瞳孔扩张的视频评估、身体位置、跑步数据和眼动追踪，在后期评估中以红十字形式显示在与小鼠注视点相对应的图像屏幕上。过去实验数据显示，与人类相比，小鼠在暴露于新图像时眼部运动明显少，因为它们中央凹的视力分辨率与周边视力分辨率大致相同。

视觉编码流程

艾伦脑观测站视觉编码流程包括（7）个步骤，如下所述。

1. Cre 驱动 x GCaMP6 报告基因：转基因小鼠品系经过基因工程改造，可以表达 GCaMP6 遗传编码的钙指示剂 (GECI)。GECI 具有局部表达，具体取决于其编码的特定细胞系或功能区域。因此，艾伦研究院的遗传学家通过选择基因、通过插入 GCaMP6 对基因进行编辑，并驱动基因表达，有效地突出了大脑以进行进一步的成像步骤。
2. 手术：小鼠进行头部固定架植入手术。如果头部固定架的稳定性被认为不适合双光子钙成像，则规定进行第二次手术以在头部固定架上涂抹额外的 Metabond。
3. 内在信号成像 (ISI)：ISI 是衡量血流动力学反应的工具，即与氧合水平直接相关的血红蛋白反射率。艾伦研究院的科学家在这一步中使用 ISI 来映射功能上定义的皮层区域和视网膜地形图。小鼠暴露于黑白色棋盘格的视觉刺激，在整个视野尺度上沿基线轴进行所有方向上的平移。然后，使用离散傅里叶变换根据输入刺激频率对视觉刺激的相位图进行计算。相位信息对于将视觉刺激映射到 V1 等皮层区域很有用。方位角和仰角图也通过分别沿方位角/仰角投影来获取，因此关于相对于中心点的方位角/仰角距离的信息得以保留。符号图是通过对相位图的方位角和仰角梯度进行正弦运算而生成的。为了标准化这种技术，将每只新小鼠与之前定义的皮层视觉区域的通用模型进行比较，该模型基于 35 个组合符号图（图 4）。自动化过程使用每个已定义视觉区域的大小、相位、位置和空间关系信息，优化新图与旧模型的符号图拟合。血管也用于确定视觉皮质边界正确的位置。这将产生一个通用的坐标框架 (CCF) 映射，这在接下来的双光子成像步骤中非常有用。

4. 习惯化：小鼠在十天的时间内适应实验装置，被动地观看图像以减少压力并允许适应。在此期间，小鼠会暴露于各种刺激图像。通过鼻子隆起、眼睛周围的过度分泌以及/或异常姿势来监测压力。
5. 体内双光子钙成像：硬件包括尼康 A[1]R MP+ 双光子成像显微镜和 910 纳米激光器。由于像素之间的荧光泄漏，即荧光从第一个成像像素传播到下一个像素，对数据进行成像后应用反卷积计算。卷积方程在下面描述

${\begin{array}{lcl}{\tilde {x}}&=&{\tilde {G}}{\tilde {y}}\\{\tilde {G}}&=&{\frac {1}{\tilde {H}}}({\frac {|{\tilde {H}}|^{2}}{|{\tilde {H}}|^{2}+\lambda \Lambda {\tilde {y}}}})\end{array}}$

其中符号表示

${\begin{array}{lcl}H&=&{\text{leakage filter}}={\text{pixel series (ym)/ time series (yT)}}\\{\tilde {H}}&=&{\text{Fourier transform of H}}\\{\tilde {y}}&=&{\text{pixel series * }}{\tilde {H}}{\text{ + noise}}\\\lambda &=&.[1]={\text{smoothness weight, empirically tested}}\\\Lambda &=&{\text{Laplacian Operator}}\end{array}}$

该公式考虑了泄漏的不均匀性，给定边缘泄漏较少而中心泄漏较大的经验发现。

激光功率在最大功率和避免像素饱和这两个约束之间进行了优化。在约 90 分钟的实验过程中，会生成约 0.1 微米的图像 z 轴堆栈。

还使用各种过滤器执行感兴趣区域 (ROI) 过滤，以创建活动细胞与背景噪声的二值化掩码。没有实现数据减少技术，而是先应用带通滤波，然后从通过低通滤波器（图 3）的自身中减去完整图像。进一步的分析包括分类分析，使用先前数据集样本中发现的物体形状、大小和面积等参数。一旦得出 ROI，图像就可以被分割成其细胞物体和背景，并且只有这些细胞物体内的荧光被传递到光电倍增管 (PMT) 以进行累加。

1. 内在信号成像：验证功能定义的视觉皮层区域是否仍以 CCF 为中心。
2. 串行双光子断层扫描：对小鼠大脑进行组织成像，以推断所有皮层区域的大脑图像的 3D 体积并检测结构异质性。

图 4：ISI 图像生成和处理

方位角和仰角测量值的可视化。

有关视觉编码管道的全部信息在 Allen 研究所白皮书 中详细解释。

钙指示剂

图 5：神经元动作电位的关键部分是钙离子的内流。这些钙离子导致神经递质囊泡向膜迁移，最终导致通过神经递质释放到突触间隙的化学传递。

钙动力学与通过神经元传导的动作电位紧密耦合。动作电位，广义上定义为快速膜去极化和随之而来的超极化事件序列，是由离子​​和离子通道产生的。电压门控离子通道是钠离子和钾离子的“司机”，通过正反馈机制随着膜电压电位的增加而打开。因此，离子电位的事件序列通常是不可变的：在一定量的钠离子内流超过阈值后，所有通道最终都会打开，膜电位将达到与细胞发射相关的最大值。钠电压门控通道通过与较慢的钾通道打开同时关闭来结束动作电位，因此钾离子可以流出并恢复静息状态的电化学梯度。然而，这种电通信仅限于单个神经元的膜，因为神经元没有物理连接，因此神经元之间的间隙连接充当电短路。化学突触传递是将信号传递到间隙连接之间所必需的。神经递质充当此角色，并且与钙动力学内在地相关。在静息状态的神经元中，神经递质被保存在突触前活性区的囊泡中。当发射动作电位时，它会打开钙离子通道，并且当动作电位继续时，进入的钙离子会流入神经元（图 5）。这些离子触发充满神经递质的囊泡向细胞表面的迁移，在那里它们释放其内容。因此，钙离子是动作电位的代表，监控它们的动力学提供了对神经元活动的基本见解。还值得注意的是，钙离子是神经可塑性和神经发育 的重要因素，神经元在生命早期。

钙指示剂具有多方面的用途 - 将钙与荧光联系起来，并将这种联系限制在局部区域。钙指示剂有两个领域：化学指示剂和遗传编码的钙指示剂 (GECI)。化学指示剂与钙离子螯合，通常通过加载的钙染料 引入特定神经元群体。这种策略有几个缺点：（1）对相同神经元群体的长期成像需要反复注射钙染料，并且容易出现人为错误，以及（2）记录的特异性仅限于空间位置，而不是细胞类型或亚细胞隔室。GECI 在检测钙动力学的比较敏感水平的同时，避开了这些缺点。由于它们是遗传编码的，因此它们可以用于慢性成像研究，这具有巨大的优势。在来自一只小鼠的单个大脑区域生成长期一致的信息对于产生大数据至关重要。目前存在两类额外的 GECI：（1）变色龙蛋白，以及（2）GFP 荧光蛋白。变色龙在与钙结合后会发生构象变化并在不同的波长下辐射。另一方面，GFP 荧光蛋白的特点是 Ca2+ 依赖性蛋白，该蛋白被编码为插入到 GFP 荧光蛋白遗传密码中的序列。GFP 荧光蛋白 GCaMP6 用于 Allen 视觉编码管道 中。

成像显微镜技术

图 6：双光子钙成像中 940-950 nm 的 GCaMP 遗传编码的钙指示剂荧光。

在选择荧光表达的报告分子后，必须决定成像技术。钙荧光成像有两个主要类别：（1）荧光显微镜，以及（2）双光子钙成像。前者，荧光成像，利用光散射效应。它可以用于对固定组织的薄切片进行成像，并记录用电荷耦合器件 (CCD) 阵列照射的激光照射的表面的发射光。但是，由于这种基于光散射的测量，它缺乏空间特异性和深度，光散射的测量会受到来自蛋白质和其他小分子在超过 100 微米的深度处的信号噪声的非平凡影响。双光子钙成像很有用，因为它克服了这些限制，实现了超过 100 微米的深度并增强了空间特异性（图 6）。

双光子钙成像与落射荧光之间的差异是通过荧光蛋白进行的：在双光子钙成像中，荧光蛋白经过蛋白质工程设计，需要两倍的波长才能被激发（约 1240 nm 与约 620 nm），将其激发范围提高到红外光谱。因此，激发是通过两个同时到达某个位置的光子实现的，即在两个激光的交叉点，分辨率约为微米。然后，通过使用光电倍增管 (PMT) 测量发射的光子来获得每微米步的成像信息。该光子信号被转换为电压，在数据收集时间段内累加，并分配给最终图像中对应于该位置的像素。

成像与电生理学

与电生理学相比，成像技术是一种相对较新的技术，由于记录信息的性质不同，在许多方面存在对比。成像记录具有不同的空间焦点，因为它在 z 深度生成 x-y 维度信息，而大多数电极相关的电生理技术则生成 z 维度深度信息。研究人员必须根据其实验目标，权衡这种差异。每种技术都存在无法完全克服的内在缺点。成像记录几乎总是间接测量，如上面详细介绍的钙成像方法。虽然钙是动作电位传播的结果，但它并不是背后的驱动力。钙成像也无法测量亚阈值电压，因为它仅限于动作电位后钙流入的触发。然而，钙成像通常对机制的侵入性较小，范围更广，并且可以生成神经活动 z 堆叠层的体内数据。这允许同时进行成像和行为数据收集，这将在下面讨论。它还考虑了钙指示剂位置的生化信息，这与电生理记录不同，后者仅限于尖峰活动或复合场电位的电信号信息。

每个实验中都需要考虑的一个重要因素是信噪比，这在成像和电生理记录中来源不同。差异在于成像所需的信号转导，其中电信号或化学信号被转换为光子，通过荧光变化与原始荧光的差值进行测量。电生理记录（如膜片钳技术）会受到仪器辅助因素的抑制。另一方面，成像中的噪声来源是离散光子，当检测到相对较低的光子水平时，这些光子会导致散粒噪声，导致在由产生的平均信号周围出现大的波动。可以通过增加表达荧光的报告分子的浓度来降低这种散粒噪声，只要不扰乱生物系统。

视觉行为管道

感觉处理与意识密切相关，因为感觉处理可能会受到自上而下的影响，如脑状态。例如，不同神经元对结构相似的图像的反应不同，这取决于对图像中发生事件的意识和预测。视野中的可识别物体将引发沿腹侧处理流的一系列动作电位。对未实现的视觉刺激的预期会导致某些神经元中钙流入增加，即放电。在瑞士温带气候中通勤时，从远处观察到的小动物通常会被识别为猫或松鼠，而不是考拉。

神经元将前馈和反馈信息整合到它们的特性中，因此，如果不尝试理解更广泛的背景影响，如意识，我们就无法完全理解视觉编码中的神经活动。鉴于此信息，为实验动物提供某种表达意识的方式非常重要。这种沟通对人类参与者来说很容易，但需要对小鼠和其他动物进行行为训练。

艾伦研究所通过视觉行为管道实施了行为分析。视觉行为管道通过与视觉编码管道相同的步骤序列进行，只是在适应后增加了行为训练步骤。

图像检测的行为训练分四个步骤进行，最终目标是通过操作性条件反射训练小鼠对图像变化做出反应。如果表现出正确的行为，操作性条件反射将奖励奖励。在适应后，自由奖励阶段引入了舔食口。第三阶段是静态光栅视觉刺激和奖励阶段。因此，在这个阶段，手头的任务是识别静态光栅旋转（从 0 度到 90 度），并且在小鼠经过适当训练后通常会获得很高的准确率。在这个阶段的初始阶段，通常会观察到过度或探索性的舔食，这表明小鼠尚未经过适当训练。

根据图像检测试验和观察到的行为反应的组合，可以观察到四种类型的试验。命中试验是训练中预期结果的“前进”试验与训练的舔食反应的组合，并会得到奖励。正确拒绝试验也是预期结果，发生在小鼠对捕捉试验没有舔食时。但是，有两种类型的错误反应：漏失试验 - “前进”试验，没有舔食 - 以及假警报试验 - “捕捉”试验，舔食。

通过这种实验训练设置，小鼠学会在图像检测任务中做出反应，使数据分析人员能够将神经活动、图像序列和通过行为反应测量的更高阶编码表示相关联。然而，实验的架构产生了几个潜在的缺陷，艾伦研究所过去已经控制了这些缺陷。首先，舔食口的位置出乎意料地相关。舔食口的位置目前是使用坐标系调整，然后记录每个小鼠的位置。当观察到舔食反应与舔食口放置相关的模式时，人们意识到这种放置很重要。当舔食口太近或太远时，小鼠明显地权衡了用水支付与舔食的努力之间的成本函数。因此，当舔食口太近时，观察到过度舔食，而当太远时，舔食受到阻碍。这种实验设置的另一个相关特征体现在图像呈现背后的算法中。图像变化不能由定时图像序列产生，否则小鼠会学会预测它。因此，必须引入随机性的因素来防止小鼠 - 及其神经元 - 预测图像变化。