三维电子显微镜/初始模型

初始建模

初始建模是使用对齐并表征的电子显微镜图像来生成所成像粒子的三维重建的过程。然而，由于每个图像仅仅是三维结构的二维投影，因此常常难以确定原始粒子的实际三维结构。为了解决这个问题，研究人员求助于投影切片定理：对于任何三维物体，它投射的每个二维投影的傅立叶变换都是原始三维物体的傅立叶变换的一个切片。因此，如果获得足够的二维投影，就可以完全重建三维物体的傅立叶变换，并通过对傅立叶变换进行反变换来对空间中的原始三维物体进行建模。

初始建模中使用了一些常见的技术，下面将描述其中的一些。

通用形状的使用

有关分子通用结构的信息可用于初始模型的形成。使用诸如球体、立方体等分子的通用形状可以帮助提供一个起点，以使用具有更高分辨率的技术获得详细的结构。从通用形状开始并逐步向高分辨率模型迈进，通常比从无到有地尝试生成模型更容易。然而，如果所选的起始形状不能准确地代表分子的实际结构，那么这种方法可能会引入显著的偏差。

现有结构的使用

先前已解决的三维结构存储在电子显微镜数据库（EMDB）或蛋白质数据库（PDB）中。使用电子显微镜获得的生物分子的三维结构被存入EMDB。EMDB的美国、日本、英国和亚洲版本均独立运行，并遵循各自的协议。类似地，使用X射线晶体学、核磁共振、电子显微镜等技术获得的蛋白质结构被存入蛋白质数据库（PDB）。提交到PDB的大约90%的结构是通过X射线晶体学获得的。PDB包含几个蛋白质结构的X、Y和Z坐标。

可以根据先前结构评估新结构，这有助于在一定程度上验证新结构。在尝试编译初始模型时，通常使用较低分辨率的现有结构，这样任何更高分辨率的细节都会被获得的数据填充，从而避免最终结构中的偏差。可以从EMDB或PDB中获取结构，将其模糊，然后用于填充新结构的细节。例如，在一项研究中，在将蛋白质和RNA结构放入50S核糖体亚基时，研究人员使用了先前已解决的通用RNA双螺旋和RNA四环，以定位50S亚基的密度图。因此，低分辨率数据可以与新的高分辨率数据相结合，以促进更好的解释。

公共线方法

分子在傅立叶空间中相交于公共线的两个投影视图。

公共线方法是一种通过利用结构的不同投影在傅立叶空间中相交的点来获得初始模型的技术。从单粒子电子显微镜获取的二维图像创建初始三维模型毫无疑问依赖于从目标分子不同视图获得的数据。公共线方法的中心特征是二维图像视图在无噪声空间中傅立叶变换的中心截面（一维）之间的明确关系。

为了使用公共线方法获得初始的三维模型重建，所有粒子都被相互比较，以试图识别角关系。由于所有粒子都有公共线，因此可以将所有粒子傅立叶变换的中心截面相互比较，以确定二维傅立叶变换的中心截面。但是，由于公共线方法严重依赖于共享一维线的识别，因此这种方法受到噪声原始图像的极大影响。作为一项规则，在噪声原始图像上使用公共线容易出错。除了与信噪比相关的限制之外，公共线方法还无法用于识别分子的手性。

随机锥形倾斜

描绘了RCT投影产生的缺失锥。

随机锥形倾斜（RCT）要求对同一组粒子拍摄两张图像——一张在高倾斜角（通常约为60°），另一张在无倾斜（0°）。这导致对采样区域中每个粒子的两个物理相关的视图。分子在无倾斜图像中的旋转角度为重建提供一个角度，样品架的角度为另一个角度，而倾斜图像用于构建初始模型。这些图像也可以被表征并分成对应于成像粒子不同方向的不同的组，从而解决异质方向样本中的大部分不确定性。

然而，RCT也存在一些限制。样品所在的铜网限制了样品可以倾斜的最大角度，并且由于配对的图像不是正交的，因此存在大量的缺失数据 - “缺失锥”。此外，由于需要对同一区域进行两次成像，因此样品会受到更大的辐射剂量。倾斜图像通常先拍摄，因此使用辐射损伤最小的图像来重建图像，但对准数据必然会受到影响，因为它来自第二个未倾斜的图像。当样品处于玻璃态冰中时，这个问题更为明显（冷冻电镜） - 因为负染色的更高电子密度有助于保护样品颗粒免受电子束的损伤，并且因为第一剂辐射通常会使冰融化，导致颗粒在第一张和第二张图像之间漂移。冷冻电镜样品的玻璃态冰通常通过在样品支架末端使用一个小容量的液氮来保存，并且任何这种容量的移动（例如，在显微镜内倾斜样品支架所需的移动）都会导致液氮沸腾，从而震动样品支架并降低所得图像的分辨率。

正交倾斜重建

正交倾斜重建 (OTR) 的工作原理与 RCT 非常相似，区别在于拍摄的配对图像彼此成 90° 角。由于样品支架的物理尺寸（如前所述），无法在 0° 和 90° 拍摄图像，因此 OTR 通过在 45° 和 -45° 拍摄图像来绕过这个问题。使用正交图像意味着结构的全部内容都在傅里叶空间中被采样，从而消除了 RCT 的“缺失锥” - 这是其主要优势。但是，它仍然与 RCT 共享其他限制，因为它仍然需要将样品区域暴露于两次辐射剂量，并且仍然需要物理移动样品支架。

OTR 还存在一个独特的限制 - 它只在所成像的颗粒在 0° 没有优先方向时才有效；换句话说，OTR 仅适用于那些在样品区域随机假设所有可能方向的颗粒。对于任何倾向于以特定方式定向的颗粒，OTR 都是不可行的重建方法。

断层扫描

断层扫描再次类似于 RCT 和 OTR，不同之处在于拍摄了更多图像，并且以不同的角度方向。同样，样品支架的物理尺寸限制了旋转角度，这意味着无法对结构的一部分进行采样 - 但与 RCT 的“缺失锥”不同，断层扫描会导致“缺失楔形”。但是，可以将多个旋转组组合起来，以生成完整的初始模型。然而，由于需要更多的图像，因此必须大幅降低每张图像的剂量，以避免样品受到辐射损伤。因此，断层扫描需要权衡 - 最大限度地提高可以收集的图像数量，同时确保每张图像的辐射量足以产生足够的对比度以进行对准。

在断层扫描中，粒子漂移成为一个更严重的问题，因为必须确定每个粒子在更多图像中的位置。因此，在颗粒中添加高电子密度的标记通常是有益的，这些标记将在每个图像中显示为恒定的暗点，并且可以用来跟踪其相关粒子在每个图像中的任何运动。