三维电子显微镜/什么是 3DEM？
冷冻电子显微镜，通常简称为“冷冻电镜”，已发展成为涵盖各种实验方法。冷冻电镜正日益成为一种主流技术，用于在分子分辨率下研究细胞、病毒和蛋白质结构[1]。图像使用电子显微镜生成，该显微镜使用电子作为辐射，由放置在高真空下的源发射，然后在 80-300 kV 的加速电压下沿显微镜柱向下推动[1]。与光学显微镜相比，电子显微镜的一个很大区别是两种方法的分辨率，电子显微镜具有更高的分辨率。显微镜的分辨率与用于形成图像的照射波长直接相关。使用的电子照射会导致生物样品受到严重损伤。减少电子诱导样品损伤的一种方法是在低温下进行该技术。在低温下（例如，用液氮冷却的液态乙烷）冷冻水溶液是用于制备冷冻电镜应用样品的一种常用方法[1]。这种方法已被证明可以很大程度地减少辐射损伤的影响，这反过来又允许研究人员使用更高剂量的电子来提高信噪比，因为辐射损伤减少了。冷冻电镜的常用变体是单粒子分析。使用这种技术，从大量 2D 投影图像（例如不同方向上相同蛋白质复合物的副本）中获得的数据被组合起来，以生成结构的 3D 重建[1]。
粒子挑选试图正确地确定粒子的位置，并在图像中区分粒子与任何污染物[2]。可以手动或通过使用自动算法选择粒子。自动算法力求将“正类”粒子与“负类”污染物或噪声区分开来[3]。自动算法可能会出现 1 类错误或 2 类错误，它们会错误地识别出正样本或负样本。
对比度传递函数 (CTF) 是由于透射电子显微镜中光学性质缺陷导致的图像数据的失真[4]。CTF 有两个原因，它们都与电子显微镜中的透镜系统有关。第一个原因是球面像差，它会导致多个焦点，从而使图像变得模糊。CTF 的第二个原因是电子显微镜中使用的欠焦。为了获得高分辨率的 3D 图像，必须校正 CTF。
堆栈是相同结构的类似图像的集合。可以通过删除不必要的信息来获得单个图像，以提高处理速度[5]。粒子框选会裁剪出图像中粒子像素尺寸 150% 的部分。粒子对比度区分了负染和玻璃化冰上的粒子，当粒子是黑色背景上的黑色时，会反转。CTF 校正将粒子在数据及其反转之间交替，以校正粒子。
在粒子对齐中，粒子的图像在许多不同的方向上移动和旋转，以尝试对齐粒子。必须将它们移动和旋转以对齐在一起以获得平均图像。平均时的目标是最大化图像的互相关[6]。粒子对齐可以分类为基于参考或无参考。根据分类，可以使用不同类型的自动包进行对齐，例如 Xmipp 最大似然对齐、Spider 参考似然对齐和 EMAN Refine 2D 无参考对齐[7]。
需要多个 2D 图像才能获得 3D 图像的结构。粒子根据结构特征（包括公共线、形状和倾斜）进行选择和组织[8]。这些粒子与其他结构相似的粒子聚集在一起，然后平均在一起[2]。3D 模型的重建依赖于粒子的方向，如中心投影定理所述[1]。
使用多种方法（例如随机圆锥倾斜或角度重构）获得初始 3D 结构后，获得的图谱被用作 3D 参考来细化单粒子方向参数（两个用于位置，三个用于方向）。然后可以通过迭代改进结构，交替进行位置和方向确定以及 3D 重建。FSC 傅里叶壳相关）和其他分辨率标准可用于跟踪结构细化的进展情况，当没有进一步改进时，细化将终止。IMAGIC、SPIDER、FREALIGN 等不同的程序可用于此目的[9]。
- ↑ a b c d e Milne, Jacqueline L, Mario J Borgnia 和 Alberto Bartesaghi。“冷冻电镜——非显微镜学家的入门。”Febs Journal.280 (2012): n. page. Print. 无效的
<ref>标记；名称“electron”在不同的内容中被多次定义。 - ↑ a b Voss, Neil。“粒子挑选。”罗斯福大学，沙堡。2013年9月13日。讲座。
- ↑ Langlois, Robert 和 Joachim Frank。“关于冷冻电镜中半自动粒子选择算法比较中所用术语的澄清。”结构生物学杂志175.3 (2011): 348-52. Science Direct. 霍华德休斯医学研究所。网络。2013年12月3日。
- ↑ Voss, Neil。“对比度传递函数。”罗斯福大学，沙堡。2013年9月27日。讲座。
- ↑ Voss, Neil。“粒子框定。”罗斯福大学，沙堡。2013年9月27日。讲座。
- ↑ Sigworth, F.J。“单粒子图像精修的极大似然法。”结构生物学杂志。122 (1998): n. page. Print.
- ↑ Voss, Neil。“粒子对齐。”罗斯福大学，沙堡。2013年10月4日。讲座。
- ↑ Voss, Neil。“初始模型问题。”罗斯福大学，沙堡。2013年11月8日。讲座。
- ↑ Voss, Neil。“3D重建。”罗斯福大学，沙堡。2013年10月25日。讲座。