蛋白质组学/蛋白质鉴定 - 质谱
介绍
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介绍
- 质谱概述
质谱是一种技术，其中气相分子被电离，并且通过观察离子在施加电场时的加速差异来测量它们的质荷比。较轻的离子将更快地加速并首先被检测到。如果质量测量得足够精确，那么就可以确定分子的组成。在蛋白质的情况下，可以确定序列。大多数提交质谱分析的样品都是化合物的混合物。获得光谱以给出样品中所有化合物的质荷比。质谱法也被称为“质谱”或简称为 MS。质谱法阐明了细胞系统内的分子机制。它用于识别蛋白质、功能相互作用，并且它进一步允许确定亚基。细胞中的其他分子，如脂质成分，也可以被定义。
质谱仪由几个不同的部分组成：一个电离样品的源，一个根据质荷比分离离子的分析器，一个“看到”离子的检测器，以及一个处理和分析结果的数据系统。您还可以使用质谱法测量离子的相对丰度。不同的化合物具有不同的电离能力，因此您的离子的强度与浓度没有直接关系。
质谱法可能是一种高通量分析方法，因为与凝胶方法相比，质谱法能够快速测量质谱，并且样品处理量最少。
它是一种分析方法，具有蛋白质组学以外的多种用途，例如同位素和测年、微量气体分析、原子定位映射、污染物检测和太空探索。
- 质谱法历史
这项技术的起源可以追溯到 100 多年前对带电环境中气体激发的首次研究。这项开创性的工作通过J.J 汤姆森在 1913 年通过质荷比区分来识别氖的两种同位素（氖-20 和氖-22）。在接下来的五十年中，该技术的根本基础得到了进一步发展。在 1959 年道化学公司研究人员将气相色谱与质谱联用后，人们认识到该技术作为一种高度准确的定量方法来探索化合物的全部潜力，从而引发了一波发展浪潮，一直持续到今天。质谱法的精确性导致了同位素的发现。
- 质谱法对蛋白质组学应用的影响
质谱法技术是蛋白质组学领域中一项宝贵的工具。它可用于通过质谱法技术的变体来识别蛋白质。蛋白质组学最常见的首要方法是自下而上的方法，其中蛋白质被蛋白酶（如胰蛋白酶）消化，然后通过肽质量指纹图谱、碰撞诱导解离、串联质谱法和电子捕获解离分析肽。一旦确定了肽的质量，就可以将质量列表发送到数据库（例如 MASCOT），在该数据库中，该列表与所有已知肽的质量进行比较。如果足够多的肽与已知蛋白质匹配，则可以识别您的蛋白质。如果您的肽的质量与已知蛋白质不匹配，则可以使用 MS/MS 方法对您的肽进行从头测序；您隔离您的肽并在肽键骨架上将其断裂，形成 y 和 b 离子，您可以从中确定序列。自下而上方法的优点是，与整个蛋白质离子相比，胰蛋白酶肽离子的尺寸小，易于生化处理，因为它们的质量相对较小，更容易确定。除了自下而上的方法外，还有另一种方法是自上而下的方法。在自上而下的方法中，使用质谱仪直接分析完整的蛋白质，而无需像自下而上的方法那样进行溶液消化。自上而下方法的优点是它有时可以提供蛋白质的完整覆盖率。但是，由于与小的肽片段相比，完整的蛋白质在生化处理方面难以处理，因此自上而下的方法难以分析。
质谱法在蛋白质组学中的另一个用途是蛋白质定量。通过用稳定的较重同位素标记蛋白质，您可以反过来确定蛋白质的相对丰度。现在，公司（如 iTRAQ (应用生物系统)）生产了套件，以便在高通量水平上执行此操作。
识别生物分子的最有效方法之一是确定其分子质量及其碎片后组成分子的质量。有两种主要的执行此操作的方法。第一个是电喷雾电离 (ESI)，其中感兴趣的离子通过施加高电场从溶液中形成。这是通过对毛细管的尖端施加高电场来实现的，溶液将通过该毛细管。样品将与氮气流一起喷入电场，以促进脱溶。液滴会形成并在真空区域蒸发。这会导致液滴上的电荷增加，现在据说离子是多电荷的。这些多电荷离子现在可以进入分析器。ESI 是一种选择方法，因为它具有以下特性：（1）相转换过程的“柔和性”允许非常脆弱的分子保持完整地电离，甚至在某些非共价相互作用中得以保留，以进行 MS 分析。（2）通过液相色谱洗脱的馏分可以喷入质谱仪，从而允许进一步分析混合物。（3）多电荷离子的产生允许测量高分子量生物聚合物。与单电荷分子相比，分子上的多个电荷会降低其质荷比。分子上的多个电荷也允许改进的碎片，这反过来又允许更好地确定结构。第二个是基质辅助激光解吸/电离 (MALDI)，其中感兴趣的分子离子通过激光脉冲照射孤立在过量基质分子中的样品而形成。这使得能够确定大于 200,000 道尔顿的大型生物分子和合成聚合物的质量，而不会降解感兴趣的分子。MALDI 的优点是其稳健性、高速以及对污染物和生化缓冲液的相对免疫。
一种通常与 MALD 一起使用的质谱仪是 TOF 或飞行时间质谱仪。这使得能够快速准确地确定摩尔质量，以及测序重复单元并识别聚合物添加剂和杂质。这项技术基于紫外线吸收基质，其中基质和聚合物与过量的基质和溶剂混合在一起，以防止聚合物聚集。然后将该混合物置于探针的尖端；然后在真空条件下除去溶剂。这会产生共结晶的聚合物分子，这些分子均匀地分散在基质中。将脉冲激光束设置为适当的频率，并将能量射向基质，基质会部分汽化。反过来，基质中均匀分散的聚合物被带入气相并带电。为了获得极好的信噪比，执行多个激光脉冲。峰的形状得到改善，确定的摩尔质量更加准确。最后，在 TOF 分析仪中，样品中的分子由于电势能差而获得相同的平移动能。这些离子分子在没有电场的真空中沿相同的距离向下移动。最小的离子首先到达检测器，检测器会为每个离子产生信号。来自多个激光脉冲的累积数据会产生 TOF 质谱，该质谱将检测器信号转换为时间的函数，这反过来可以用来计算离子的质量。
除了这些电离技术外，还开发了功能强大的质谱分析仪。这些分析仪以高精度和高速测量完整电离的生物分子的质荷比及其碎片光谱。碎片光谱的测量称为串联质谱法或 MS/MS。与单级 MS（使用完整的母离子）结合，串联质谱法可用于帮助阐明蛋白质，因为阐明问题将简化为组装碎片蛋白质的拼图碎片。
参考文献
- 美国质谱学会 - 什么是 MS？，http://www.asms.org/whatisms/p4.html
- 后基因组时代质谱法
- 生物化学年度评论 第 80 卷：239-246（卷出版日期 2011 年 7 月）DOI：10.1146/annurev-biochem-110810-095744 https://ted.ucsd.edu/webapps/portal/frameset.jsp?tab_tab_group_id=_2_1&url=%2Fwebapps%2Fblackboard%2Fexecute%2Flauncher%3Ftype%3DCourse%26id%3D_767_1%26url%3D
- 伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校化学科学学院 http://scs.illinois.edu/massSpec/ion/esi.php
- 南密西西比大学聚合物与高性能材料学院 http://www.psrc.usm.edu/mauritz/maldi.html