蛋白质组学/蛋白质鉴定 - 质谱/仪器

介绍	蛋白质鉴定 - 质谱	质谱类型
	仪器

本节

质谱仪是如何工作的？

质谱仪由三个部分组成：离子源、质量分析器和检测器。未知样品，可能是固体、液体、溶液或蒸汽，被送入电离源。电离样品后，样品的离子被送入质量分析器区域，在那里根据质荷比进行分离。一旦被分析器分离，离子就进入质谱仪的检测器部分。在这一点上，机器计算每个不同离子的质荷比和相对丰度。根据这些信息，可以创建像右边这样的光谱图。

大多数质谱仪都保持在真空状态，以提高离子从电离源到检测器移动过程中不受空气分子碰撞干扰的几率。

离子源

离子源是质谱仪中将样品电离的部件。电离主要用于将样品以蒸汽离子的形式呈现，以便质量分析器对其进行作用，并由离子检测器测量。有许多不同的方法可以电离样品，例如正离子或负离子模式。选择的电离方法应取决于样品的类型和质谱仪的类型。

电离方法

File:ES-MassSpec.jpeg

电喷雾电离

有三种类型的电离方法，电子电离、化学电离和光诱导电离。电子电离涉及对样品施加电流以诱导电离。化学电离涉及样品与试剂分子相互作用以诱导电离。产生的离子通常用符号表示，这些符号表明电离的性质，例如 [M+H]+ 用于表示被质子化的分子。

电子电离
- 电喷雾电离
- 场解吸/场电离
化学电离

蛋白质组学中常用的方法是“基质辅助激光解吸电离”或 MALDI 和“电喷雾电离”，也称为 ESI。大气压化学电离和大气压光电离也是两种形式。

MALDI 使用固体支撑靶板，其中在板上点涂 UV 活性基质（固体或液体），然后在基质上点涂样品。激光照射到结晶基质上的点，并将能量从基质分子转移到样品。这种能量转移使样品汽化，并将一束离子送入 MALDI 源。然后收集这束离子并保持在源中，直到脉冲将它们同时发送出去。如果 MALDI 连接到飞行时间 (TOF) 质量分析器，这些离子就会被送到 TOF 管（通常约 2 米）中，并根据它们的速率（轻离子先到达）进行分离。MALDI 是蛋白质组学的首选仪器，因为它易于读取光谱；大多数离子都在 +1 电荷状态 [M+H] 中被发现。

另一方面，电喷雾是通过将溶解在弱酸性溶液中的样品注射到带有约 10 伏电压的加热毛细管中来完成的。这使得在毛细管尖端形成高电荷粒子。当粒子蒸发时，它们的电荷/体积增加到电荷排斥力接管的程度，粒子会爆炸。会形成一个小液滴，继续这个过程，直到单个分子处于气相并带电。然后，这些离子将进入分析器（通常是四极杆），逐个质量进行扫描。电喷雾中的分子往往是多电荷的，即使四极杆的上限质量为 2000 m/z，多电荷也允许识别高质量离子或蛋白质。蛋白质将具有一个电荷包络，其中每个峰具有不同的电荷量。需要专门的软件来将多电荷物种峰解卷成单个质量峰，例如 Waters 的 MassLynx。这种电离形式适用于大多数化合物，但对于中性或低极性分子来说并不是最佳选择。

大气压化学电离涉及样品与试剂分子相互作用以诱导电离。与电喷雾电离一样，液体通过毛细管泵送。在尖端，它被雾化，并发生电晕放电，使分子电离。这些分子与分析物相互作用并转移它们的电荷。这种电离形式适用于小的热稳定分子。

大气压光电离在分子被雾化后使用光子激发和电离分子。这种电离形式适用于中性化合物。

质量分析器

质量分析器是根据它们的质荷比分离离子源产生的离子的部件。质量分析器基于带电粒子在电场或磁场中的原理。利用洛伦兹力定律和牛顿第二运动定律，可以生成以下方程



     $({\frac {m}{q}})\mathbf {a} =\mathbf {E} +\mathbf {v} \times \mathbf {B}$

其中 m 是质量，离子电荷是 q，a 是加速度，E 是电场，离子速度和磁场的向量叉积是 v x B。该方程表明，两个具有相同质荷比 (m/q) 的粒子将表现出完全相同的行为。

所以这个方程实际上是在说，质荷比充当离子加速度的决定因素，这也可能表示为电场加上离子速度和磁场的叉积之和。

扫描质量分析器

扫描质量分析器需要根据离子的相对丰度和质荷比进行分离。电磁场用于根据离子的质荷比分离离子，通过使用狭缝，它们能够调节哪些质荷比离子到达检测器。一旦选择了一个特定的质荷比，离子电流就会被记录为时间的函数，这类似于质量。

扇形质谱仪

使用质量分析器（在其内部使用磁性、电气或静态扇形）的质谱仪称为扇形仪器。这也与扇形组合使用，例如 BEB，磁性-电气-磁性。在当今，这些扇形仪器大多是双聚焦的，即离子束在方向和速度方面都被聚焦。下面介绍磁性扇形质谱仪的工作原理，想象一个位于两个电磁体之间的管状物。当电子从一端通过管子到另一端时，磁场通过对其施加转动力来弯曲电子流。然后确定 m/z 比例。

Orbitrap 质谱仪

Orbitrap 质谱仪是将离子置于切向产生的电场中的质谱仪。这些离子也捕获在外部电极之间，而离子被静电吸引到内部电极，这种吸引力被离心力平衡。因此，这些离子以圆周方式围绕内部电极运动，并且以特定 m/z 比例来回运动。通过使用这种基于 m/z 比例的离子振荡，捕获器可以充当质量分析仪。

四极杆质谱仪

您可以将此方法视为一个过滤器或漏斗，它只允许某些离子质量通过。这个“漏斗”实际上是正负带电金属杆的组合，它们一起形成了一个通道，离子通过该通道。理论上，只有选定的质量才能通过通道，因为所有其他离子将无法稳定地穿过通道，而是会撞击四极杆，阻止离子到达检测器。

离子阱四极杆质谱仪

四极杆离子阱质谱仪由一个环和两个端盖的双曲线电极组成，这是该仪器的核心。在这种方法中，离子被捕获，然后从离子阱中依次弹出到传统的电子倍增检测器中。这样，所有离子都可以在质量分析过程中被储存。最近的研究表明，在捕获体积中使用 1 mtorr 的氦气可以显着提高仪器的分辨率，离子的动能降低，离子轨迹收缩到捕获器的中心。可以用给定 m/z 的离子形成一个数据包。由于分辨率高且成本低廉，这种质谱仪在商业用途上被广泛使用。

线性四极杆质谱仪

在线性离子阱质谱仪中，离子被捕获在一组四极杆棒内，以径向保持离子，并用端部电极以静态电势保持离子轴向。简单地说，与使用三维场的四极杆离子阱不同，线性四极杆离子阱使用二维场。它具有选择性质量过滤器，用于检测特定 m/z 比例的离子。这种方法具有更高的离子存储容量和更快的扫描技术的优势。

飞行时间质量分析仪

TOF（飞行时间）是一种质量分析仪，它允许离子流过无场区域；这使得速度更快的离子（即质量更轻的离子）首先到达检测器。这与 MALDI 尤其兼容，因为 TOF 需要脉冲式仪器作为其源。这样，离子在 MALDI 源中产生并保持在那里一段时间，所有离子在完全相同的时间脉冲进入 TOF。这样，如果所有离子具有相同的动能，则质量较低的离子将具有更高的速度，并首先到达检测器；而质量较高的离子将具有较低的速度，最后到达检测器。

离开源的离子的动能由下式给出

     $T=eV={\frac {mv^{2}}{2}}$

其中速度 v 由路径长度 L 除以时间 t 定义。

     $v={\frac {L}{t}}$

将此方程代入第一个方程并求解时间，得到

     $t=L*{\sqrt {({\frac {m}{e}})*({\frac {1}{2V}})}}$

从这个方程中，您可以很容易地看到质量如何直接影响飞行时间。质量与时间成正比。使用方程的 m/e 部分，您可以清楚地看到较大的质量意味着更长的时间，反之亦然，较低的质量意味着较小的 m/e，因此飞行时间更短。

离子回旋共振质谱仪

ICR 是一种捕获离子质量分析仪，专门定义为静态捕获器。它基本上是一个盒子，有三个平行的金属侧面。捕获离子分析仪通过将离子保持在捕获器中，并使用正负带电电场以一系列精心安排的时间事件来控制离子，从而工作。

ICR 的工作原理是，在磁场中，离子以圆周路径运动，其频率与质量有关。因此，使用回旋频率，您可以推测出质量。将磁场中的洛伦兹力与向心力的方程等价，得到

     $evB={\frac {mv^{2}}{r}}$

然后，您可以轻松地求解上述方程以得到频率 F，即

     $F={\frac {v}{r}}$

具有相同质荷比的离子组将具有相同的回旋频率，但可能不同步运动，这就是为什么需要激发脉冲将共振离子与激发脉冲同步的原因。接下来，经过 ICR 单元接收板附近的离子会产生“镜像电流”，这些电流可以被收集、放大和分析。在接收板中记录的信号取决于离子数量及其到接收板的距离。

傅里叶变换

这种质谱仪包含一个质量分析仪，该分析仪使用离子的回旋频率来确定它们的 m/z 比例。这里使用一个磁场，其中具有电捕获板（称为彭宁阱）用于保持离子。一个与磁场成直角的振荡电场用于将捕获的离子激发到更大的回旋半径。这会导致振荡离子数据包。捕获板检测信号作为镜像电流，并产生一个包含正弦波的干涉图，称为自由感应衰减 (FID)。通过对该数据执行傅里叶变换，可以生成具有有用信号的质谱图。

检测器

通过分析仪的离子现在通过所需的方法被分离。这种质谱仪组件记录了离子经过表面时产生的电荷，或者离子撞击表面时产生的电流。根据这些电荷或电流，可以生成质谱图，以及测量每个 m/z 处存在的离子总数。由于进入检测器的离子数量在任何给定时刻都非常少，因此通常需要信号放大。

下一节：质谱类型

参考文献

实验技术：MALDI TOF，http://www.microbiology.science.ru.nl/tech/malditof/
质谱入门，http://www.astbury.leeds.ac.uk/facil/MStut/mstutorial.htm
电子电离源：基础知识，http://www.spectroscopymag.com/spectroscopy/article/articleDetail.jsp?id=358670
其他产生离子的技术有哪些？，http://www.asms.org/whatisms/p11.html
磁扇区质谱，http://www.wooster.edu/Chemistry/analytical/ms/default.html
http://en.wikipedia.org/wiki/Orbitrap
四极杆离子阱质谱的来龙去脉，http://www.abrf.org/ABRFNews/1996/September1996/sep96iontrap.html
http://en.wikipedia.org/wiki/Quadrupole_ion_trap
傅里叶变换离子回旋共振理论：简要回顾，http://www.emsl.pnl.gov/docs/msd/mass_spec/home/fticrtut.html
傅里叶变换质谱，http://www.bumc.bu.edu/Dept/Content.aspx?DepartmentID=385&PageID=7205

文章摘要

液相色谱-质谱联用技术在临床生化中的原理及应用

Pitt JJ. 临床生化学评论 卷：3019-34 (2009)

主要关注点

液相色谱 - 质谱联用技术的一个优势是，它有多种配置，可以根据实验需要获得更有针对性的结果。

摘要

由于技术的效率低下，LC-MS 技术起步缓慢。然而，在 1990 年代中期，随着新技术的开发，它变得越来越流行。这部分是由于其高度特异性，以及能够处理比当时其他可用方法（如 GC-MS）更复杂的混合物的能力。质谱法首先将样品电离，生成带电的分子碎片，然后分析它们的质荷比。LC-MS 中的质谱部分使用不同的技术来获得不同的结果，其中一些技术比其他技术更通用，例如改变离子源、改变质量分析器、改变离子抑制以及改变直接进样方法。

可以在临床上使用的不同离子源包括电喷雾电离源、大气压化学电离源或大气压光电离源。电喷雾电离，也称为 ESI，适用于极性分子；代谢物、异源生物和肽就是一些例子。大气压化学电离源，也称为 APCI，是分析小分子热稳定分子和中性非极性分子（如游离类固醇）的理想分析仪。大气压光电离，也称为 APPI，适用于中性化合物，如类固醇。

有四种不同的质量分析器可供使用；它们是四极杆分析器、飞行时间分析器、离子阱分析器和混合分析器。四极杆分析器使用广泛，因为它们易于扫描且能够提供高质量的定量数据。飞行时间分析器由于其高灵敏度，适用于分析小分子。离子阱分析器能够多次对离子进行碎片化，从而提供所谓的 MSⁿ 功能。混合分析器可以在离子阱模式和传统的四极杆模式之间切换。

在 LC-MS 的液相色谱部分，也可以改变不同的步骤，使该程序更加通用，例如改变流速、流动相、分离度和通量以及定量（校准）。LC-MS 中涉及的参数和条件可以改变以优化分析。但是，这些条件特定于特定的分析物和 LC 分离。因此，不存在通用条件。这些条件中的一些包括使用分析物的稀溶液以及使用单级质谱或串联质谱。重要的是确保 LC-MS 系统运行正常，并采用协议来检测与正常性能的偏差。LC-MS 用于生化筛查遗传性疾病以及治疗药物监测和类固醇激素。

新术语

GC-MS: 气相色谱-质谱联用 (GC-MS) 是一种将气相色谱和质谱的特点结合起来的方法，用于识别测试样品中的不同物质。 (http://en.wikipedia.org/wiki/GC-MS)
离子源: 产生气体离子、聚焦、加速并以窄束发射的装置。也称为离子枪；电离源。 (http://www.answers.com/topic/ion-source )
校准: 一组刻度，用于指示值或位置——通常用复数形式。 (http://www.merriam-webster.com/dictionary/calibration )
偏差: 与公认的行为规范明显或显著偏离。 (http://www.merriam-webster.com/dictionary/deviation )
异源生物: 一种对活体生物体而言是外来的化合物（如药物、农药或致癌物质）。 (http://www.merriam-webster.com/dictionary/xenobiotics )

课程相关性

这如何与蛋白质组学课程相关？

能够分析蛋白质的组成非常重要，以便我们能够了解该蛋白质对生物体的影响。能够看到给定蛋白质与其正常对应物之间的差异可能有助于理解遗传疾病。LC-MS 使科学家能够进行蛋白质分离。

网站总结

什么是质谱法？

Chiu CM, Muddiman DC. http://www.asms.org/whatisms/index.html (3/28/09)

主要关注点

本网站讨论了什么是质谱法，它的历史以及它的工作原理。

摘要

质谱法是一种强大的分析技术，用于识别未知化合物、定量已知化合物以及阐明分子的结构和化学性质。可以识别出浓度非常低的化合物。质谱法被各种专业人士使用，例如医生、天文学家和生物学家。例如，它可以监测麻醉师在手术过程中患者的呼吸，并确定太空中发现的分子物质的成分。它可以用来识别生物分子的结构以及对它们进行测序。它还用于识别和定量复杂有机混合物的化合物。质谱法是由 J.J. 汤姆逊在真空管中发明的。他的发明被用于发现许多同位素，确定同位素的相对丰度，并测量它们的“精确质量”，这对从地质年代学到生化研究等不同领域的后续发展奠定了基础。

质谱仪是一种测量单个分子的质量的仪器，这些分子通过带电而被转化为离子。质谱仪实际上并没有直接测量分子质量，而是测量从分子形成的离子的质荷比。离子上的电荷由基本电荷单位的整数表示，而质荷比则表示为道尔顿/基本电荷单位。结果以生成的质谱图形式表示。质谱图是离子强度作为质荷比的函数的图形。

新术语

道尔顿: 用于表示原子、分子或核粒子的质量的质量单位，等于最丰富碳同位素原子质量的 1/12。 (http://www.merriam-webster.com/medical/dalton )
电晕: 高压下在电导体表面附近出现的微弱辉光。 (http://www.merriam-webster.com/dictionary/corona )
质谱图: 根据离子的质量电荷比分离的气态离子流谱图（http://www.merriam-webster.com/dictionary/mass%20spectrum）。
阐明: 通过解释或分析使某事物清晰明了（http://www.merriam-webster.com/dictionary/elucidate）。
同位素: 指同一化学元素的两种或多种原子，其原子序数相同，化学性质几乎相同，但原子质量或质量数不同，物理性质也不同（http://www.merriam-webster.com/dictionary/isotopes）。

课程相关性

这如何与蛋白质组学课程相关？

蛋白质组学是蛋白质的研究，其定义是在不同条件下对蛋白质组进行定性和定量比较，以进一步揭示生物过程。质谱法可以用来研究生物体的组成部分以及它们如何产生其个体功能。