蛋白质组学/蛋白质鉴定 - 质谱
演示文稿
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介绍
- 质谱概述
质谱是一种技术，其中气相分子被电离，并且通过观察离子在施加电场时加速的差异来测量它们的质荷比。较轻的离子将更快地加速并首先被检测到。如果质量测量得足够精确，那么可以识别分子的组成。在蛋白质的情况下，可以识别序列。提交到质谱的大多数样品都是化合物的混合物。获取光谱以给出样品中所有化合物的质荷比。质谱法也称为“质谱”或简称MS。质谱法揭示了细胞系统内的分子机制。它用于识别蛋白质、功能相互作用，并且进一步允许确定亚基。还可以定义细胞中的其他分子，例如脂质成分。
质谱仪由几个不同的部分组成：一个电离样品的源，一个根据质荷比分离离子的分析仪，一个“看到”离子的检测器，以及一个处理和分析结果的数据系统。您还可以使用质谱法测量离子的相对丰度。不同的化合物具有不同的电离能力，因此您的离子的强度与浓度没有直接关系。
由于能够快速测量质谱并且与凝胶方法相比，样品处理量最小，因此质谱法可以成为一种高通量分析方法。
它是一种分析方法，在蛋白质组学之外具有各种用途，例如同位素和年代测定、痕量气体分析、原子位置映射、污染物检测和太空探索。
- 质谱的历史
这项技术的历史可以追溯到 100 多年前在带电环境中首次对气体激发的研究。这项开创性的工作通过J.J Thomson 在 1913 年通过质荷比区分来识别氖的两种同位素（氖-20 和氖-22）。在接下来的 50 年中，该技术的根本基础得到了进一步发展。在 1959 年将气相色谱与质谱联用后，Dow Chemical 的研究人员认识到该技术作为一种高度准确的定量方法来探索化合物的全部潜力，从而引发了一波发展浪潮，这些浪潮一直持续到今天。质谱的精确性导致了同位素的发现。
- 质谱对蛋白质组学应用的影响
质谱技术是蛋白质组学领域中的一项宝贵工具。它可以通过质谱技术的各种变化来识别蛋白质。蛋白质组学最常见的第一种方法是自下而上的方法，其中蛋白质被蛋白酶（如胰蛋白酶）消化，然后通过肽质量指纹图谱、碰撞诱导解离、串联质谱和电子俘获解离来分析肽。确定肽质量后，可以将质量列表发送到数据库（例如 MASCOT），在该数据库中，将该列表与所有已知肽的质量进行比较。如果足够多的肽与已知蛋白质的肽匹配，则可以识别您的蛋白质。如果您的肽的质量不匹配已知蛋白质，则可以使用 MS/MS 方法通过从头测序对您的肽进行测序；您隔离您的肽并沿肽键骨架断裂，形成 y 和 b 离子，您可以从中确定序列。自下而上方法的优点是，与整个蛋白质离子相比，胰蛋白酶肽离子的尺寸小，易于生物化学处理，因为它们相对较小的质量更容易确定。除了自下而上的方法外，另一种方法是自上而下的方法。在自上而下的方法中，完整的蛋白质通过质谱仪直接分析，无需像自下而上的方法那样进行溶液消化。自上而下方法的优点是可以有时提供蛋白质的完整覆盖范围。但是，由于与小的肽片段相比，整个蛋白质难以生物化学处理，因此自上而下的方法难以分析。
质谱在蛋白质组学中的另一个用途是蛋白质定量。通过用稳定的较重同位素标记蛋白质，反过来可以确定蛋白质的相对丰度。现在，公司生产了各种试剂盒，例如 iTRAQ (应用生物系统)，以便在高通量水平上执行此操作。
确定生物分子的分子量及其在断裂后的组成分子的质量，是识别生物分子最有效的方法之一。执行此操作的两种主要方法。第一个是电喷雾电离 (ESI)，其中感兴趣的离子通过施加高电场从溶液中形成。这是通过将高电场施加到毛细管的尖端来实现的，溶液将从该尖端穿过。样品将与氮气流一起喷射到电场中，以促进去溶剂化。液滴将形成并在真空区域蒸发。这会导致液滴上的电荷增加，并且现在据说离子是多电荷的。这些多电荷离子现在可以进入分析仪。由于以下特性，ESI 是首选方法：(1) 相变过程的“柔和性”允许非常脆弱的分子保持完整地电离，甚至在某些非共价相互作用中保持完整，以便进行 MS 分析。(2) 通过液相色谱的洗脱馏分然后可以喷射到质谱仪中，允许对混合物进行进一步分析。(3) 多电荷离子的产生允许测量高分子量生物聚合物。与单电荷分子相比，分子上的多个电荷将降低其质荷比。分子上的多个电荷也有助于改善碎裂，从而更好地确定结构。第二个是基质辅助激光解吸/电离 (MALDI)，其中感兴趣的分子离子通过激光脉冲撞击在样品上形成，样品被隔离在过量基质分子中。这使得能够确定大于 200,000 道尔顿的大型生物分子和合成聚合物的质量，而不会降解感兴趣的分子。MALDI 的优点是其稳健性、高速以及对污染物和生化缓冲液的相对免疫力。
一种经常与 MALD 结合使用的质谱仪是 TOF 或飞行时间质谱法。这使得能够快速准确地确定摩尔质量，以及对重复单元进行测序并识别聚合物添加剂和杂质。该技术基于紫外线吸收基质，其中基质和聚合物与过量的基质和溶剂混合在一起，以防止聚合物聚集。然后将这种混合物放在探针的尖端；然后在真空条件下除去溶剂。这会产生共结晶的聚合物分子，这些分子均匀地分散在基质中。脉冲激光束设置为适当的频率，并发射能量到基质中，基质部分汽化。反过来，基质中均匀分散的聚合物被带入气相并带电。为了获得出色的信噪比，执行多次激光射击。峰的形状得到改善，测定的摩尔质量更加准确。最后，在 TOF 分析仪中，样品中的分子由于电势能差而获得了相同的平移动能。这些离子分子沿没有电场且距离相同的真空管向下运动。最小的离子最先到达检测器，检测器会为每个离子产生信号。来自多次激光射击的累积数据会产生一个 TOF 质谱，它将检测器信号转换为时间的函数，反过来可以用来计算离子的质量。
除了这些电离技术外，还开发了功能强大的质谱仪。这些分析仪测量完整电离生物分子的质荷比及其碎裂光谱，具有很高的准确性和速度。碎裂光谱的测量称为串联质谱或 MS/MS。与单级 MS（具有完整的母离子）结合使用，串联质谱可以用来帮助阐明蛋白质，因为阐明问题将简化为组装碎裂蛋白质的拼图碎片。
参考资料
- 美国质谱学会 - 什么是 MS？，http://www.asms.org/whatisms/p4.html
- 后基因组时代中的质谱法
- 生物化学年度评论第 80 卷：239-246（卷出版日期 2011 年 7 月）DOI：10.1146/annurev-biochem-110810-095744 https://ted.ucsd.edu/webapps/portal/frameset.jsp?tab_tab_group_id=_2_1&url=%2Fwebapps%2Fblackboard%2Fexecute%2Flauncher%3Ftype%3DCourse%26id%3D_767_1%26url%3D
- 伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校化学科学学院 http://scs.illinois.edu/massSpec/ion/esi.php
- 南密西西比大学聚合物和高性能材料学院 http://www.psrc.usm.edu/mauritz/maldi.html