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使用体内31P 核磁共振波谱法检测大西洋鳕鱼 (Gadus morhua L.) 临界游泳背后的代谢过程
在最近的一项研究中，体内 31P 核磁共振波谱被用于检测大西洋鳕鱼临界游泳背后的代谢过程。临界游泳速度 (Ucrit) 被认为是鱼类无法继续向前推进并最终疲惫的速度。31P 核磁共振波谱被用于与布雷特式游泳池结合，以便对 Ucrit 游泳测试期间发生的进程进行详细分析。
Ucrit 游泳测试最初旨在分析鲑鱼适应性对温度的依赖性。布雷特将这种临界速度定义为鱼类无法继续向前推进并最终疲惫的游泳速度。先前对不同游泳模式和为鱼类肌肉收缩提供能量的代谢过程的分析表明，红肌是氧化性的，在亚梭形游泳期间产生缓慢收缩，而白肌是糖酵解的，负责快速抽搐收缩，在爆发式游泳期间产生尾部踢动。在临界游泳速度期间发生的肌肉疲劳期间观察到无机磷酸盐的增加和细胞内环境的酸化，但确切的机制尚未确定。然而，无氧踢动滑行（快速抽搐）爆发留下的产物表明了鱼类的代谢状态。这些产物使研究人员能够检测游泳步态与代谢过程之间的关系。尽管 Ucrit 游泳测试提供了有关大西洋鳕鱼游泳能力以及 Ucrit 期间大西洋鳕鱼肌肉中代谢产物的的信息，但它们没有详细说明底层过程，例如这种速度下疲劳的原因。
体内 31P 核磁共振波谱已被证明是一种非侵入性监测肌肉中细胞内 pH 变化以及 ATP、磷酸肌酸 (PCr) 和细胞内磷酸盐 (Pi) 等磷基化合物代谢状态的有效方法。尽管先前的研究仅限于分析静止或受限的动物，但已经开发出越来越多的技术，用于非侵入性地检测静止条件下不受限的鱼类。在这项研究中，体内 31P 核磁共振被证明是一种实用且有效的方法，用于分析 Ucrit 测试期间大西洋鳕鱼的代谢过程。
第一代养殖的东北极地鳕鱼 Gadus morhua L. 在被转移到 10ºC 水族箱之前，在 4ºC 条件下饲养至少两周，每周两次喂食至饱。实验前五到七天停止喂食。
游泳池装置包含三个主要部分：一个有机玻璃™管道连接到循环系统，并通过一个直径为 40 厘米的布鲁克 Biospec 47/40（在 4.7 T 下运行）进行馈送。当管道关闭时，海水被密封以测量氧气消耗量。当打开时，一个不断充氧的海水储层被用于冲洗系统。三个大型水龙头被用于在两个循环之间交替。封闭系统的密封性定期通过在晚上用氮气冲洗海水，然后监测海水在 12 小时内的氧气含量来检查。在实验过程中，未检测到氧气含量的增加。一个数字运动摄像系统连接到计算机，用于监测鱼类。循环系统是温度控制的，所有游泳速度都经过校正以消除固体阻塞效应。大量关于 31P 核磁共振的先驱性研究涉及淡水鱼类研究。早期的研究仅限于静止或受限的动物，但最近的创新使人们能够在静止条件下对不受限的鱼类进行非侵入性分析，例如本研究中遵循的实验程序。
体内 31P 核磁共振谱主要从白肌获得，红肌的贡献微乎其微。使用 200 μs bp32 脉冲（翻转角为 45º，扫描宽度为 5000 Hz，4 k 时，重复时间为 0.8 秒）收集光谱。收集了总共 256 次扫描，这导致总采集时间约为三分钟。对每个游泳速度，在 30 分钟的时间段内记录核磁共振谱。
实验结果表明，当鳕鱼接近 Ucrit 时，发生了代谢转换点。这种转变是从稳态有氧代谢到无氧代谢，这与鱼类从亚梭形游泳转换为踢动滑行游泳同时发生。在线测量了支撑从缓慢游泳到踢动滑行，然后到完全疲劳的游泳转变的代谢过程，并确定了 Ucrit 为完全疲劳的点；当接近 Ucrit 时，氧气消耗量和尾拍频率增加。确定观察到的肌肉疲劳是由于 ΔG/dξATP 下降到 –49.8±0.7•kJ•mol–1 造成的。该值似乎低于转运蛋白维持离子梯度和为肌肉提供能量所需的特定阈值。
观察到，当 Ucrit 开始时，Pi 开始增加，而 pHi 开始酸化。研究人员得出结论，确定 pHi 何时降低（在 Ucrit 处或之前）对于评估从稳态有氧代谢到非稳态无氧代谢的转变至关重要。先前假设 Pi 的生理积累会导致肌肉产生的功率下降，因为 Pi 会移动到肌浆网中以沉淀钙离子并减少稳态张力。Ucrit 处的平均 Pi 浓度升高，这导致在快速收缩-松弛循环期间产生更大的力量重新发展。这些结果表明在游泳过程中进行了踢动滑行爆发。此外，检测到的 pHi 下降导致工作脱皮肌肉纤维兴奋性增加。确定当 Pi 增加而 PCr 减少时，细胞能量储存会在 Ucrit 时耗尽以缓冲细胞 ATP 浓度。随之而来的 pHi 下降表明无氧代谢用于维持 ATP 水平。
总的来说，研究人员得出结论，体内 31P 核磁共振波谱与布雷特式游泳池相结合，是一种分析大西洋鳕鱼在临界游泳速度期间代谢特征的有效方法。通过这种方法，确定随着游泳速度的增加，以及在临界游泳速度之前，步态从亚梭形游泳转换为踢动滑行游泳，细胞内 pHi 在氧气消耗量指数增加期间下降。同时，PCr 水平下降，而 Pi 水平上升。这些变化在 Ucrit 时达到最大值，并在恢复期间恢复。ATP 水解的吉布斯自由能变化在 Ucrit 时最小，被认为是导致鳕鱼疲劳的最重要因素。这意味着从稳态有氧代谢到非稳态无氧代谢的转变最终导致有氧和无氧燃料储备在临界游泳速度时完全耗尽。
Bock, C.H.; Lurman, G.J.; Portner, H.O. 使用体内 31P 核磁共振波谱法检测大西洋鳕鱼 (Gadus morhua L.) 临界游泳背后的代谢过程。J Exp Biol. 2007, 210(Pt 21), 3749-56.
31P 核磁共振波谱在评估丙型肝炎病毒相关肝病抗病毒治疗反应中的应用
31P 核磁共振波谱已被用于评估丙型肝炎病毒相关肝病抗病毒治疗反应。本研究的目的是评估 31P 核磁共振作为干扰素和利巴韦林治疗反应生物标志物的应用。干扰素和利巴韦林已被证明可以在至少一半的记录病例中消除病毒，从而防止 HCV 感染进展为肝硬化。研究人员使用 31P 核磁共振波谱来观察随着丙型肝炎相关疾病严重程度的增加，肝脏中磷酸单酯 (PME) 与磷酸二酯 (PDE) 的比率增加。
据估计，全球人口中有 3% 患有慢性丙型肝炎病毒 (HCV) 感染，而每年约有 400 万人新感染。在大约 20% 的病例中，纤维化发展为肝硬化，这会导致每年 5% 的病例发生肝细胞癌。肝活检是慢性肝病分期和分级的参考标准。然而，这是一种侵入性程序，死亡率低，但误差率高，主要原因是抽样不足。这促使研究人员开发更有效的非侵入性方法来评估肝损伤。31P 核磁共振波谱是表征慢性肝病的一种方法。过去，这种方法被证明是确定疾病严重程度的有效手段。
47 名患者（29 名男性和 18 名女性，平均年龄为 47.5 岁）经活检证实患有 HCV 相关肝病，接受了干扰素和利巴韦林的病毒清除治疗，并被纳入英国的常规临床方案。所有患者在决定进行抗病毒治疗之前，都接受了基线肝活检，以评估肝脏炎症的严重程度。所有患者在开始病毒清除治疗三个月内也接受了基线治疗前 31P 核磁共振波谱检查。治疗开始后，所有患者每六个月进行一次重复成像，持续最长十八个月。所有患者也接受了干扰素 α 和利巴韦林或聚乙二醇干扰素 α 和利巴韦林治疗，持续至少 12 周。
用 1.5 T 磁共振成像机获得肝脏 31P 核磁共振谱，该成像机配备有包围式发射线圈和单独的表面接收线圈。这两个线圈都针对 64 MHz 的质子和 26 MHz 的磷进行了双调谐。T1 加权图像确认了患者的位置，并使用质子信号获得。使用图像选择体内波谱序列将光谱定位到肝脏中心位置的体素。对每个患者使用右肝脏内远离主要血管的体素位置，并且对所有基线和随访图像保持一致。每次 31P 核磁共振序列的总检查时间为 40 分钟，采集时间为 10 分钟。所有成像都在晚上进行。
使用高级精确、稳健和高效谱拟合 (AMARES) 算法记录相对于时间的 31P 信号的量化。该算法位于磁共振用户界面 (MRUI) 软件程序中。蒙蔽观察者分析并重新检查核磁共振谱，以确保匿名性。获得相对于总磷信号强度的 PME、PDE 和无机磷酸盐 (Pi) 峰面积。
患者根据持续病毒清除被归类为抗病毒治疗的应答者，该持续病毒清除是通过定量HCV RNA聚合酶链反应研究获得的。研究人员将持续病毒学应答定义为在完成抗病毒治疗后至少六个月内反复测得的不可检测的HCV RNA。
越来越多的HCV感染患者的评估和治疗已成为主要的临床关注点。虽然活检仍然是大多数HCV相关肝病分期和分级的参考标准，但该程序仍存在相当大的风险。越来越明显的是，肝脏活检产生的结果不如31P-NMR方法获得的结果准确。31P MR波谱法比肝活检更显著的优点之一是它的非侵入性应用和对肝脏的更大采样量，比肝活检样本大很多倍。使用干扰素-α或聚乙二醇干扰素-α和利巴韦林治疗被证明是针对HCV相关肝病患者的有效病毒清除疗法，通过31P MR。这种方法的病毒清除发生在至少一半的患者中，但取决于潜在的基因型。通过31P MR波谱法测定的PME/PDE比率已被证明是肝硬化的重要指标。在这项研究中，观察到持续病毒学应答组的PME/PDE比率向正常值显著降低。然而，该比率在病毒学无应答者中保持静止或增加。PME共振也包含来自细胞膜前体的贡献，而PDE共振包含来自细胞膜降解复合物的贡献。这些特征使PME/PDE比率能够提供关于肝细胞周转的信息。有了这些知识，研究人员惊讶地发现，在有效的病毒清除治疗后，并且在肝硬化组的四位应答者中的三位中，该比率出现了降低。
通过31P MR波谱法评估PME/PDE比率并非没有缺陷。具体来说，这项研究中的三位患者被发现PME/PDE比率降低，这表明肝病减轻。这与发现这些患者没有持续应答的发现相矛盾，这些发现是基于长期随访病毒学研究的结果。还发现两位患者的PME/PDE比率恶化，尽管通过长期病毒学随访研究确定了病毒的消退。似乎评估HCV相关肝病患者的PME/PDE比率的最实用方法应包括长期病毒学随访研究。研究人员还将抗病毒治疗后至少24个月的组织学发现进行关联，以确保所使用的31P MR波谱法的准确性和可靠性。这项研究中另一个潜在的缺陷可能是排除了纤维化的相关血清学生物标志物。这导致患者随访程序期间出现困难。为了限制排除这些生物标志物带来的实验误差，可以使用更大规模的患者群体。
总而言之，似乎通过31P MR波谱法测定的PME/PDE比率可能是抗病毒治疗应答的重要指标。此外，31P MR波谱法已被证明是这种评估中肝活检的有效替代方案。研究人员指出，用于这项研究的MR波谱序列可以自由添加到任何标准的MR肝脏成像方案中。虽然该序列确实将成像方案延长了大约10分钟，但对于丙型肝炎患者的代谢物而言，重要数据的显著增加是值得注意的。
Kuo，Y.T.；等。31P MR波谱法评估丙型肝炎病毒相关肝病抗病毒治疗的应答。J Exp Biol. 2007, 189(4), 819-23。
冷保存期间胰腺ATP水平的实时无创评估
31P-NMR波谱法已被用于无创监测大鼠和猪胰腺ATP:Pi比率。这种方法使研究人员能够同时评估现有冷保存（CP）方案在维持器官质量方面的有效性。在大鼠胰腺模型中，观察到用组氨酸-色氨酸-酮戊二酸溶液（HTK）/全氟癸烷双层法（TLM）进行CP与在空气中暴露的（HTK）中进行CP相比，ATP:Pi比率水平显着提高。与TLM相比，在用分子氧饱和的HTK溶液中保存大鼠胰腺导致ATP:Pi比率略微提高。因此，确定TLM对于改善大鼠胰腺模型中的氧合和提高ATP水平是有效的。尽管在分析TLM保存的猪胰腺时，研究人员在NMR光谱中没有发现可识别的ATP峰。这表明TLM在该模型中效率较低。这些结果支持以前的研究，这些研究表明TLM无法完全氧合更大的猪和人类胰腺。
使用TLM进行CP的前9小时内ATP:Pi比率的增加可能反映了重新氧合动力学和在获取期间缺血后发生的ATP再生。此外，CP 12小时后ATP:Pi比率的降低与CP 8至9小时后分离产量下降相一致。据信这表明存在限制CP的关键附加因素。研究人员确定，31P-NMR的非侵入性能力提供了实时信息，使其成为识别限制CP的因素以及衡量和评估现代器官保存方法的有效工具。
Avqoustiniatos，E.S.；等。冷保存期间胰腺ATP水平的实时无创评估。Transplant Proc. 2008, 40(2), 403-6。
脂链长度和不饱和度对双细胞稳定性的影响：磷NMR研究
31P NMR已被用于确定脂链长度和不饱和度对双细胞稳定性的影响。大多数先前涉及由长链脂类和短链脂类的二元混合物形成的磁性可对齐系统的研究都是基于1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（D14PC）和1,2-二己酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（D6PC）脂类的混合物。研究人员最近发现，这种脂类混合物的大部分相图可以通过考虑长链脂类和短链脂类在长链脂类的熔融转变温度（Tm）以上加热时部分混溶来理解。当改变两种脂类中的一种的链长时，研究人员能够控制它们的混溶性。这使得能够控制在磁场中观察到自发对齐的温度和成分间隔。使用31P-NMR，研究人员证明了这些二元脂类混合物的独特性质与短链脂类扩散到双层区域的趋势相关。研究人员还确定，可以使用不饱和脂类（例如1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC））形成具有类似特性的脂类混合物。
已确定，当长链脂类和短链脂类的脂链长度改变一个或两个碳时，大多数独特的双细胞混合物性质得以保留。还发现，这些相同的性质在很大一部分不饱和脂类（例如1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC））中得以维持。实验结果表明，在磁场中观察到自发对齐的温度范围取决于所使用的脂类。这种温度依赖性被确定为是脂类之间混溶性变化的结果。在给定温度下，已发现这种混溶性取决于不匹配的脂链长度、长链脂类的主要转变温度和短链脂类对边缘部分的亲和力。研究人员了解了形成可对齐脂类结构的潜在力量。因此，现在可以预测哪些脂类混合物会对齐，并设计在所需温度范围内对齐的混合物。这些能力已被证明在生物应用中特别有用，这些应用包括可溶性蛋白质的部分定向、膜蛋白掺入或药物封装。
Devaux，P.F.；Triba，M.N.；Warschawski，D.E.脂链长度和不饱和度对双细胞稳定性的影响：磷NMR研究。Biophys J. 2006, 91(4), 1357-67。
31P NMR已被证明是一种有效、非侵入性的技术，用于监测代谢系统，分析ATP和其他含磷化合物的在生物系统中的作用，以及观察特定刺激对利用含磷化合物的生物系统的影响。疾病研究似乎是31P-NMR的一种实用且新兴的应用。特别是，31P-NMR已被应用于详细说明丙型肝炎病毒相关肝病抗病毒治疗的反应，并且还被用于分析阿尔茨海默病和麦卡迪尔病中基于磷的化合物活性。31P NMR最近也已应用于食品分析，并且似乎是分析食品中基于磷的化合物水平的重要未来应用。这种技术也可能在未来代谢组学研究中得到更多应用，代谢组学涉及绘制人类代谢过程、参与这些过程的代谢物以及评估刺激对这些过程的影响。当前的代谢组学研究招募了31P NMR波谱法来记录二硝基苯酚在青鳉（Oryzias latipes）胚胎中的毒性作用。31P NMR已被用于表征完整胚胎中的ATP和磷酸肌酸代谢。
Brown，G. G.；等。阿尔茨海默病和多发性皮质下梗塞性痴呆的体内31P NMR图谱。Neurology. 1989, 39, 1423。
Lewis，S. F.；Haller，R. G.；Cook，J. D.；Nunnally，R. L. 使用31P-NMR研究麦卡迪尔病的肌肉疲劳：葡萄糖输注的影响。J Appl Physiol. 1985, 59, 1991 – 1994。
Spyros，A.；Dais，P. 31P NMR波谱法在食品分析中的应用。1. 橄榄油中单甘油酯和二甘油酯组成的定量测定。J Agric Food Chem. 2000, 48(3), 802 – 805。
同行评审文章＃1
通过体内31P NMR、HPLC-UV和1H NMR代谢组学确定的二硝基苯酚在青鳉（Oryzias latipes）胚胎中的毒性作用
水生毒理学 第76卷，第3-4期，2006年3月10日，第329-342页
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