蛋白质组学/蛋白质样品制备/蛋白质处理和储存
随着时间的推移，蛋白质结构会发生变化，这可能会改变实验结果。蛋白质处理不当也会导致许多问题。样品中的污染物会导致结果出现偏差，甚至会损坏设备。然而，在蛋白质处理和储存过程中，可以采取许多措施来最大限度地减少任何损坏，从而最大限度地提高结果的准确性。
在处理蛋白质样品时，戴上手套非常重要。通常，戴上手套是为了保护我们在处理有害物质时，但手套也用来保护样品不受我们手上任何外来蛋白质或化学物质的影响。污染不仅会导致意外结果，还会损害我们的样品。出于同样的原因，使用无菌容器、移液器吸头等也至关重要。
在某些情况下，可能希望储存蛋白质以便在几个月后使用；最常见的是通过冷冻实现。通过将蛋白质储存在-20摄氏度以下的温度，可以保存分子的结构成分，直到使用为止，确保其功能。然而，如果冷冻过程没有正确进行，蛋白质实际上会发生 pH 值和盐浓度急剧变化。为了避免随着时间的推移而发生这些环境变化，可以将样品“快速冷冻”，方法是将装有蛋白质样品的试管浸入干冰、乙醇和丙酮的混合物中。冷冻后，可以将样品迅速在水杯中解冻。
在进行任何蛋白质组学实验时，必须注意样品中蛋白质或肽可能因其化学性质而造成的损失。例如，疏水性蛋白质在溶液中粘附到试管或色谱柱壁的情况并不少见。如果已知目标蛋白质是疏水性的，则可以使用 **硅烷化** 的玻璃器皿或购买硅烷化玻璃器皿，以防止蛋白质损失。
微型活检、激光捕获显微切割和干细胞治疗只能提供少量非传统样本，为了利用这些微小样本，需要一种更少的浪费样品制备方法。三氟乙醇为此提供了一种可行的替代方案。
压力循环技术 (PCT) 在反应容器中交替压力。例如，将样品放入一个密闭的容器中，然后将容器中的压力在极高压力和室压之间交替变化。当压力从极高下降到室压时，可压缩分子（如脂质）往往会解离。一个有用的解离例子是双层脂质膜的解离，这会导致蛋白质和其他代谢物从双层脂质层中释放出来。
PCT 辅助液液萃取 [1] 利用 PCT 将样品分离成不同的类别，在同一个反应容器中使用类别特异性不混溶溶剂。将初始溶剂与原始样品混合，然后提高压力。随着压力的峰值，溶剂混合，形成临时溶剂，样品溶解在这个新的临时溶剂中。降低压力，临时溶剂重新分离成初始溶剂，在此过程中分离溶解的样品（不同类别的样品分子在特定的初始溶剂中溶解度更高）。在室压下，每类样品分子在每个初始不混溶溶剂中被发现分离。
主要重点
使用有机共溶剂 (TFE) 代替传统洗涤剂可以最大限度地减少样品损失。
摘要
微型活检、激光捕获显微切割和干细胞治疗只能提供少量非传统样本，为了利用这些微小样本，需要一种更少的浪费样品制备方法。
蛋白质组学样品处理的典型方案通常涉及使用强变性剂，如尿素或盐酸胍，以及不同类型的洗涤剂。这些方法速度很快，然而，在进行 LC-MS 分析之前，需要从样品中完全去除洗涤剂或盐。如果未正确去除，检测灵敏度水平可能不足以检测肽。当处理小于微克的样品大小时，这些程序显示出其缺点，因为在去除洗涤剂时，不可避免地会留下一些样品。
为了解决使用去污剂带来的问题，我们采用了一种仅需单管的样本制备技术。该技术使用三氟乙醇（TFE）代替去污剂，并将其溶解在低渗水溶液缓冲液中。TFE 更优越，因为它可以提高蛋白质的溶解度和变性，并且易于蒸发，因此在不再需要 TFE 时无需将其移除。因此，使用 TFE 代替去污剂可以省去清理步骤，从而避免了去除去污剂产生的废物。
我们使用两种不同的老鼠脑组织样本进行实验以验证该假设。一个样本在变性剂和 CHAPS 缓冲液中被破坏，而另一个样本在含有 50% TFE 的低渗缓冲液中被破坏。两种样本的色谱图表明，第一个样本中去污剂的存在抑制了与去污剂共洗脱的肽段的信号。使用 TFE 协议比使用 CHAPS 协议识别出更多的蛋白质。此外，即使在处理后的 MCF 细胞中，TFE 也被证明比传统的基于去污剂的协议更有效，识别出的蛋白质数量比使用传统方法更多。
基于 TFE 的协议在微型和纳米级样本处理方面被证明比传统方法更有效。使用基于 TFE 的协议的主要优势是消除了额外的清理步骤，整个过程都在一个试管中进行，因此无需手动操作，也不会造成样本损失。TFE 的其他优点包括提高蛋白质溶解度，增强蛋白质变性，最后它可以通过胰蛋白酶消化去除，无需进行任何额外的清理步骤。基于 TFE 的协议还提供了更好的样本回收率和更好的重现性。
新术语
- 有机溶剂
- 一种通常为液态的化学化合物，含有碳，可以溶解另一种物质（溶质）。(http://www.knowledgebank.irri.org/glossary/Glossary/O.htm)
- 三氟乙醇
- 化学式为 CF3CH2OH 的有机化合物。也称为 TFE 或三氟乙基醇，这种无色、可与水混溶的液体具有类似于乙醇的气味。(http://en.wikipedia.org/wiki/Trifluoroethanol)
- 液相色谱
- 一种基于样品化合物在固定相和液体流动相之间的分配的色谱分离方法。(http://www.nhml.com/resources_NHML_Definitions.cfm)
- 固相萃取
- 一种分离过程，用于根据物质的物理和化学性质从混合物中去除某些化合物。(http://en.wikipedia.org/wiki/Solid_phase_extraction)
- 两性离子
- 一种总净电荷为 0 的化学化合物，因此呈电中性，但其不同原子带有形式上的正负电荷。(http://en.wikipedia.org/wiki/Zwitterionic)
- 体素化
- 对大脑基因表达进行多体积图像的高通量采集。(http://labs.pharmacology.ucla.edu/smithlab/publications_files/pdf/Singh_JNM_2003.pdf)
课程相关性
在尝试检测蛋白质组中不同蛋白质时，样本制备效率可能是一个大问题，因为如果蛋白质组一开始只含有少量特定蛋白质，那么在制备过程中样本的任何损失都可能意味着部分或全部蛋白质的损失。因此，学习各种不同的样本制备方法，特别是最高效的方法，对于希望处理和制备蛋白质组样本的学生来说非常有用。
基于静水压循环技术的组织分馏：用于系统生物学研究的统一样本制备技术
[edit | edit source]主要重点
作者提出了一种新型的、无去污剂的、同时取样过程，该过程利用压力循环技术 (PCT) 作为新过程的基础，从同一样本中高效提取多种生物分子类别。新过程的一大优势是，样本可以直接用于另一个（兼容的）过程进行进一步分析（如质谱），或者在进一步分析之前仅需进行最小的清理。强调了其与系统生物学研究的相关性。[2]
摘要
鉴于系统生物学研究的日益普及，提高分析样本的一致性和质量变得越来越重要。许多当前的高质量取样技术都针对单一类型的分析（DNA/RNA、蛋白质或脂质）。同时取样技术很重要，特别是在系统生物学研究中，因为分析过程中必须将来自多个分子类别的信息进行关联。在样本量很小的情况下（例如，人体活检组织），同时取样技术也是至关重要的。
作者开发了一种新的同时取样协议，该协议使用无去污剂的过程，将 DNA、RNA、蛋白质和脂质 cleanly 分开。新协议利用压力循环技术 (PCT) 以及一套专有的分配试剂，根据类别分离分子。PCT 通过快速改变压力，从高压到低压，使分子相互作用不稳定。高压主要影响可压缩的分子（脂质），随后在压力降低时解离。PCT 不会影响共价键，因此 DNA、RNA 和蛋白质保持完整，而脂质双层被拆解。
PCT 辅助液液萃取是另一种基于 PCT 的技术，用于在给定一组分配溶剂的情况下分配样本。例如，将两种互不相溶的溶剂与样本混合。然后提高压力，溶剂开始融合。当压力足够高时，溶剂混合并形成一种临时的三元溶剂，其中样本溶解。然后降低压力，三元溶剂分离回最初的两种溶剂，原始样本的颗粒被分配到两种溶剂中的任一种。当压力恢复到“正常”时，原始样本已 cleanly 分配到不同的溶剂相中。在之前的工作中，作者已发展了上述基于 PCT 的技术，并取得了一些商业上的成功。新开发的 ProteoSolve-SB 协议在此基础上进行了改进，因此新协议能够从单个样本中 cleanly 分离 DNA、RNA、蛋白质和脂质。
将 ProteoSolve-SB 与当前的协议进行比较，包括 Thizol、AllPrep 和 PARIS。Thizol 显示出良好的 DNA 回收率，但存在从有机相缓慢提取和清理的缺点，以及可能发生蛋白质修饰的缺点。Thizol 适用于相对较低的样本浓度（小于体积的 10%），而 ProteoSolve-SB 兼容高达 25% 至 30% 的总样本浓度。样本浓度是一个重要因素，因为后续的沉淀过程在样本浓度更高时效率更高。
AllPrep 的 RNA 回收率体积与 Thizol 和 ProteoSolve-SB 相似，但是它是一个更昂贵的过程，并且测试程序需要多个柱子。AllPrep 还存在潜在蛋白质损失的副作用：许多蛋白质可能不会从 RNA 上解离，因此可能无法回收。此外，回收的蛋白质必须在 SDS-PAGE 之前进行清理；清理过程可能会导致额外的蛋白质损失。
PARIS 回收的 RNA 比其他测试协议少一半，这是预期的，因为只有一半的样本用于 RNA 分析：另一半用于蛋白质分析。除了 RNA 收率低之外，回收的蛋白质还需要额外的清理（透析、过滤）。
ProteoSolve-SB 已被证明可以产生高 DNA、RNA 收率，以及大量的蛋白质回收率和简化的脂质回收率（步骤少于其他方法，动手时间更少）。通过 PCT 进行样本均质化可以产生更一致的样本，而不是超声处理或在液氮中研磨。离心后，分析只需进行最小的清理：蛋白质在干燥后即可使用；脂质可直接用于 MALDI-TOF 质谱分析；DNA、RNA 可以使用常见且兼容的提取协议从固相中提取。未来的工作将集中在进一步缩小该过程的规模，以便用于针头活检以及来自单个干细胞的细胞培养。
新术语
- 活检
- 从活体中移除并检查组织样本，用于诊断目的。[3]
- 透析
- 利用溶液中物质在半透膜上的不等扩散进行分离。[4]
- 静水压
- 与静止的流体或流体施加或传递的压力有关。[5]
- 超声处理
- 通过高频声波破坏细胞或 DNA 分子。也称为超声波处理。[6]
- 系统生物学
- 一个研究生物系统各个部分（代谢途径、细胞器、细胞和生物体）之间的关系和相互作用，并整合这些信息以了解生物系统功能的领域。 [7]
课程相关性
这种新方法可提供低蛋白质损失率，并且避免使用可能在蛋白质被进一步分析之前改变蛋白质的去污剂和其他溶剂。它与蛋白质组学相关，因为它提供了一种从细胞组织中提取蛋白质的另一种方法，以减少原始样品中蛋白质的损失和/或污染。对于独特的或难以获得的样品，它也是一个相关的方法。
蛋白质去污剂清理：一种气相色谱法用于定量膜蛋白结构研究中常用的去污剂
气相色谱法 http://www.separationsnow.com/coi/cda/detail.cda?chId=3&id=20260&type=Feature&page=1/ (2009-01-26)
主要焦点 蛋白质提取的传统方法涉及使用去污剂。虽然它们会影响蛋白质的稳定性，但在人们了解有机溶剂的优点之前，它们在提取中使用了很长时间。
摘要
蛋白质的结构在不同的功能环境中进行研究，条件与正常条件不同。最常用的方法是在蛋白质的提取、纯化、浓缩和结晶中使用去污剂。但是，去污剂的浓度对蛋白质的稳定性有很大影响。使用四种去污剂癸基麦芽糖苷、十二烷基麦芽糖苷、十二烷基磷酸胆碱和月桂基二甲胺基 N-氧化物说明了测量与蛋白质相关的去污剂量的过程。去污剂的分离是在 200-280C 的温度梯度和 1 微升的低进样量下进行的。所有这四种去污剂的保留时间适合于分离和鉴定去污剂混合物。在实验条件下进行了分离，得到的校准曲线与二次回归曲线相匹配。因此，这是从蛋白质中分离去污剂混合物最简单的方法之一。
新术语
- 两亲性
- 包含极性和非极性部分的分子。（http://www.biology-online.org/dictionary/Amphipathic）
- 二次回归
- 它是一个过程，在这个过程中，为一组数据找到最佳拟合抛物线的方程。（http://calculator.maconstate.edu/quad_regression/index.html）
- Centricon 过滤
- Centricon 过滤装置通过超滤提供快速高效的生物大分子浓缩和脱盐。（http://www.millipore.com/userguides/tech1/p99259）
- 洗脱缓冲液
- 洗脱缓冲液用于洗去先前实验中残留的任何蛋白质。（http://wiki.answers.com/Q/What_is_an_elution_buffer）
- 气相色谱法
- 一种方法，通过将样品汽化成载气流并将气体通过含有选择性保留（吸收）和释放挥发性成分的物质的色谱柱来分离混合物的成分。（http://www.biotechmedia.com/definitions-g.html）
课程相关性
基于去污剂的提取用于提取蛋白质。其中最先进的方法是使用有机溶剂提取蛋白质，通常不需要分离，它们会蒸发。
压力循环技术 (PCT)：一种针对富含脂质样品的新型生物标志物发现和药物开发样品制备方法
主要重点
PCT 将通过为从业人员提供一种安全高效地将生物样品分馏成特定生物类别（蛋白质、脂质）的技术来提高基于蛋白质组学的研究所需的发现率，在某些情况下（尤其是对于蛋白质），这些技术可以直接输入常见的下游分析过程。
摘要
美国的主要疾病仍然是生物学研究的目标：即肥胖、心脏病和糖尿病。[8] 这些疾病之间的关系以及生物学机制的分析都非常复杂。需要改进的过程和技术来对抗这些疾病，特别重要的是更有效的药物发现和药物开发周期。此类改进将越来越多地支持复杂的科研工作，包括利用生物标志物和蛋白质组学推动发现前进。
在蛋白质组学领域，存在一些需要解决的重要技术挑战，包括对更低蛋白质浓度的过程的需求，以及在组织蛋白质组学中，感兴趣的蛋白质主要存在于脂质中。样品制备技术在蛋白质组学实验的结果中起着重要作用，目前许多制备技术存在安全、污染、加工时间长且不易自动化的缺点。使问题更加复杂的是，有些技术只适用于特定的样品类型。结果，实验结果不容易、可靠地复制。
在高脂浓度组织中发现的蛋白质对于我们理解重要疾病至关重要。使用去污剂带来了挑战，因为样品中并非所有蛋白质都可能暴露出来，尤其是当脂质浓度超过 60% 且样品在水溶液中制备时。此外，去污剂并不总是与后续分析程序兼容。在某些情况下，感兴趣的蛋白质还与细胞碎片一起被丢弃。这些类型的挑战会对研究的步伐产生负面影响。
压力循环技术 (PCT) 解决了上述问题。在单一步骤中，使用所有有机（非基于去污剂）溶剂，脂质和蛋白质以对研究人员非常安全的方式解离和分配。基于 PCT 的液-液萃取用于捕获不同溶剂馏分中的解离分子。将样品添加到不互溶溶剂的混合物中。接下来，PCT 利用反应容器中的高压来分解和混合样品与液体溶剂。在高压释放后，样品分子在初始液体溶剂中被分馏。PCT 中的反应容器（特殊反应管）设计用于承受高压，将样品和溶剂与污染物隔离，并为研究人员提供安全性。PCT 在将蛋白质从脂质组织中释放出来方面特别有效。
在一项压力生物科学公司和哈佛大学公共卫生学院之间的研究中，对脂肪组织的蛋白质组学分析结果被认为对糖尿病和肥胖的机制研究有用。在这项研究的结果中，据报道 PCT 与更“传统”的技术相比具有更高的蛋白质产量。PCT 结果产量高且易于获得。PCT 也与下游蛋白质鉴定方法 (HPLC-ES/MS) 兼容。PCT 过程也高度可重复。
其他应用可能包括那些处理神经系统疾病的应用，例如阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症、多动症、抑郁症和/或精神分裂症。神经系统疾病是一个有趣的研究目标，因为髓鞘（覆盖神经元细胞的大部分）的蛋白质/脂质比率约为 3 比 7。磷脂倾向于成为膜蛋白，对神经元调节很重要 - 因此，磷脂也是一个有趣的研究目标。
新术语
- 脂肪细胞
- 专门用于合成和储存脂肪的动物结缔组织细胞。这些细胞被甘油三酯小球膨胀。[9]
- 生物标志物
- 可用于测量疾病进展或治疗效果的生化特征或方面。[10]
- 空化
- 在承受快速剧烈压力变化的液体中形成和瞬时坍塌无数微小空隙或空洞。超声辐射产生的空化有时用于进行剧烈的局部搅拌。由剧烈湍流引起的空化通常会导致空化损伤。[11]
- 脱脂
- 去除脂质或脂质基团，通常是从蛋白质中去除。[12]
- 不互溶
- 不能混合而不分离相。水和石油在大多数情况下是不互溶的，尽管它们可以通过添加乳化剂而变得互溶。[13]
课程相关性
PCT 与蛋白质组学相关，因为它是一种高效、安全、自动化、可重复的样品制备技术的基础，在从脂质组织中提取蛋白质方面尤其重要。
- ^ Gross V, Carlson G, Kwan AT, Smejkal G, Freeman E, Ivanov AR, Lazarev A. Journal of Biomolecular Techniques 19:189-199 (2008)
- ^ Pressure Biosciences http://www.ngpharma.com/article/Issue-9/Drug-Discovery/Pressure-Cycling-Technology-PCT-a-Novel-Sample---Preparation-Approach-to-Biomarker-Discovery-and-Drug-Development-in-Lipid-Rich-Samples/ (2009-03-24)
- ^ Steve Down
- ^ 系统生物学 来自 http://publications.nigms.nih.gov/thenewgenetics/glossary.html#S
- ^ 超声处理 来自 http://www.fao.org/docrep/003/x3910e/X3910E22.htm
- ^ 透析 来自 http://wordnetweb.princeton.edu/perl/webwn?s=dialysis
- ^ 流体静力学 来自 http://www.merriam-webster.com/dictionary/hydrostatic
- ^ 活检 来自 http://en.wiktionary.org/wiki/biopsy
- ^ 生物标志物 来自 http://www.medicinenet.com/parkinsons_disease/glossary.htm
- ^ 空化 来自 http://www.hghouston.com/c.html
- ^ 脂肪细胞 来自 http://www.bcerc.org/glossary.htm
- ^ 脱脂 来自 http://en.wiktionary.org/wiki/delipidation
- ^ 不混溶 来自 http://www.pneumatic-source.com/resources/glossary/i.shtml
Jörg von Hagen, VCH-Wiley 2008 蛋白质组学样品制备。 ISBN 978-3-527-31796-7