蛋白质组学/蛋白质分离- 电泳/差异凝胶电泳 (DIGE)
差异凝胶电泳 (DIGE) 是一种用于监测不同功能状态下细胞间蛋白质组谱差异的技术。这分三步进行。首先，样本用独特的荧光染料标记。其次，它们在同一个 2D-PAGE 凝胶上一起运行。最后，运行完成后，同一个凝胶的不同荧光图像相互叠加。DIGE 允许研究差异表达的蛋白质，以及样本之间共同存在的蛋白质。该技术允许在一个凝胶上同时分离和比较最多三个样本。[1]
在传统的 2D-PAGE 中，不同的样本通常在多个凝胶中分离。然后将这些凝胶叠加以比较一个凝胶与另一个凝胶。由于凝胶之间在空间分辨率和斑点强度方面的差异，图像的叠加和蛋白质的正确匹配很困难。等电聚焦条带的蛋白质吸收量可能存在差异，蛋白质从第一维凝胶到第二维凝胶的转移可能不完整，凝胶成分、场强或 pH 梯度可能存在局部不一致。这些凝胶间差异可能会掩盖样本之间的生物学差异。不幸的是，并非所有这些变化都是可以避免的；它们可能由于多种原因而发生。因此，使用 2D-PAGE 难以对蛋白质表达水平进行定量比较。
在 DIGE 中，蛋白质混合物在电泳前预先用花青染料标记，以确保蛋白质的共迁移。这种在同一个凝胶上的共迁移消除了样本之间的运行差异。此外，样本在整个实验过程中都处于相同的环境和相同的程序中。以这种方式将实验变异降至最低。在 DIGE 中，无需在电泳后处理凝胶进行可视化。
用于 DIGE 的花青染料（Cy2、Cy3 和 Cy5）是 N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物，共价标记蛋白质的赖氨酸残基的 ε-氨基，并将 ε-氨基的正电荷替换为染料的正电荷。染料的结合为蛋白质引入了小的但匹配的分子量增加。由于这些染料是疏水的，为了防止蛋白质沉淀，每个蛋白质只标记一个赖氨酸残基（最小标记）。最小标记限制了荧光强度，从而限制了染料的灵敏度。所有染料在电荷和分子量上都匹配，以防止等电点的改变，并将电泳过程中染料诱导的标记蛋白质的位移降至最低。[2]
还存在另一类花青染料，称为饱和染料，它们饱和半胱氨酸残基，而不是最小标记赖氨酸残基。同样，这些染料在质量和电荷上是匹配的；但蛋白质修饰和等电点偏移的可能性较小。饱和半胱氨酸染料对最小赖氨酸标记具有更高的灵敏度。与最小赖氨酸标记花青染料一样，如果蛋白质中不存在半胱氨酸氨基酸，则饱和染料将无法对其进行标记，导致蛋白质无法检测。
首先用丙基-Cy3 和甲基-Cy5 标记两种蛋白质样本。标记样本后，将其应用于单个 2D-GE 凝胶。运行完成后，通过依次用每种染料的激发波长照射凝胶来可视化相应的蛋白质斑点。使用成像软件分析得到的蛋白质斑点。然后从凝胶中切下差异表达的蛋白质斑点，并通过质谱法鉴定。
为了研究多个样本，需要大量成对比较或分析在不同凝胶上运行的样本。一个重要的替代方法是使用第三种染料 (Cy2)，其特性与 Cy3 和 Cy5 相似。用 Cy3 或 Cy5 标记蛋白质样本，并将包含实验中所有样本等量混合的样本用 Cy2 标记。然后将所有样本应用于同一个凝胶。混合样本作为每个凝胶上每个蛋白质斑点的内部标准，然后用于对所有凝胶上的所有斑点进行归一化。这种方法减少了实验变异，提高了定量的准确性和蛋白质表达差异的统计置信度。[3]
为了研究蛋白质的差异表达，无需运行多个凝胶。由于不需要进行电泳后处理（固定或脱色），即使在低分子量范围内，蛋白质的损失也会减少。这种方法比标准比色染色方法更定量，无论是在灵敏度方面还是在线性方面。
- ^ Mustafa Ünlü, Mary E. Morgan 和 Dr. Jonathan S. Minden。“差异凝胶电泳：检测蛋白质提取物变化的单一方法。” 电泳 (1997)，18：2071-2077。
- ^ Gert Van den Bergh，Lutgarde Arckens。“荧光二维差异凝胶电泳揭示了基于凝胶的蛋白质组学的潜力。” 生物技术现状 (2003) 15：38-43。
- ^ Attard，B. 等。“二维差异凝胶电泳 (DIGE)：一种用于高通量蛋白质组学的新方法。http://www.asbmb.org.au/magazine-sample/2004-August_%20Issue35-2/Technical%20Feature%202%20-%20Attard.pdf