蛋白质组学/蛋白质分离- 电泳/一维凝胶电泳
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 是一种非常常见的凝胶电泳方法，用于根据质量分离蛋白质。 SDS-PAGE 最初被称为 Laemmli 方法，以其发明者 U.K. Laemmli 的名字命名。该技术的主要部分发生在蛋白质进行电泳之前；它们在称为十二烷基硫酸钠 (SDS) 的去污剂中变性。SDS 通过与蛋白质的疏水核心结合使蛋白质变性，并赋予每种蛋白质与其质量成比例的负电荷。SDS 以约 1.4 克 SDS 每 1.0 克蛋白质的比例与蛋白质结合，但可能在 1.1-2.2 克 SDS 每克蛋白质之间变化 [1]。蛋白质可以进一步用还原剂处理，例如二硫苏糖醇 (DTT)，以破坏任何重新形成的二硫键，然后用碘乙酰胺烷基化以防止二硫键进一步重新形成。
该过程的最终结果是变性的蛋白质变得线性，因此所有蛋白质具有相似的结构，并且可以根据其分子量进行分离。与传统的凝胶电泳不同，传统的凝胶电泳需要将蛋白质分解成线性片段才能进行分析，SDS-PAGE 允许对整个蛋白质进行分析。
有关凝胶、染色和电泳分析的更多详细信息，请参阅本章的“凝胶电泳”部分。
在等电聚焦 (IEF) 中，蛋白质通过穿过包含 pH 梯度的凝胶的电流进行分离。蛋白质的电荷取决于其氨基酸侧链的电荷。这些电荷随 pH 值而变化。蛋白质将通过 pH 梯度移动，直到其电荷为零，因为中性分子不会被阴极或阳极吸引。蛋白质呈中性的 pH 值称为等电点。
固定 pH 梯度 (IPG) 用于 IEF，因为固定 pH 梯度即使在非常高的电压下也能长时间保持稳定。缓冲化合物用于创建 IPG 的 pH 梯度。IPG 是具有塑料背衬片的铸造凝胶条，并在不同的 pH 范围和长度上可商购。它们提供高分辨率、高重复性和允许高蛋白负荷。 [2] 等电聚焦在用于提取或溶解蛋白质的相同溶液中进行。
加载有蛋白质的 IPG 条必须在再水化/样品缓冲液中再水化。再水化可以是主动的或被动的。为了加载更大的蛋白质，施加了一个小电压，导致主动再水化。电泳完成后，聚焦条可以冷冻保存。
天然 PAGE 用于根据蛋白质的电荷密度差异分离蛋白质的天然状态。蛋白质的天然状态是其正确折叠的状态，而不是变性或展开的。在天然 PAGE 中，重要的是凝胶或缓冲液中不存在变性剂。否则，蛋白质将无法保持其天然状态。许多蛋白质在通过天然 PAGE 分离后被证明具有酶活性。因此，它用于制备纯化和活性蛋白质。天然 PAGE 可以在接近中性 pH 的条件下进行，以防止酸和碱的变性；它有助于研究单个构象以及聚集或自缔合。通过保持设备和样品冷藏，可以进一步减少变性和蛋白水解。 [3]
蛋白质的迁移率取决于其电荷和大小。任何特定蛋白质的氨基酸组成和翻译后修饰决定了其电荷。较小的蛋白质或电荷较高的蛋白质在电泳过程中比较大的蛋白质或电荷较低的蛋白质移动得更远。
维基百科在其数据库中为 SDS-PAGE、IEF 和 Native-PAGE 设置了页面。下面列出了所有这三者的链接
- ^ Mullins, Dyche。 “SDS PAGE 凝胶到底是如何工作的？” http://mullinslab.ucsf.edu/protocols/html/SDS_PAGE_protocol.htm
- ^ “等电聚焦。”（康奈尔大学）http://instruct1.cit.cornell.edu/Courses/biobm330/protlab/IEF.html
- ^ “等电聚焦。” http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Life_Science/Proteomics_and_Protein_Expr_/Protein_Analysis/Protein_Electrophoresis/Isoelectric_Focusing.html
- ^ “天然凝胶。” http://www.ap-lab.com/native_gels.htm