蛋白质组学/蛋白质分离- 电泳/凝胶电泳
凝胶电泳 (GE) 用于根据其物理特性区分分子实体。这些决定性特征包括尺寸、形状、电荷和等电点。等电点可能是最重要的特征；它是分析物上的总电场力为 0 的点，因此也是分析物在凝胶中停止迁移的点。凝胶电泳用作分析技术或作为制备技术，用于在用于其他方法（如质谱法）之前纯化分子，质谱法基于以下原理：当带电分子置于电场中时，它们会根据其电荷迁移到正极或负极。由于核酸由于其磷酸基团而带负电，因此它们会迁移到阳极。与核酸不同，蛋白质可以具有净正电荷或净负电荷，因此它们可以迁移到任一极，具体取决于电荷。
蛋白质的形状和电荷对凝胶电泳过程中的蛋白质迁移行为有很大影响，尤其是在电泳之前没有使蛋白质变性时。聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 通常用于分离蛋白质。PAGE 可用于在其他蛋白质组学技术之前纯化蛋白质或分析蛋白质的质量、电荷和/或存在的信息。由于这些复杂的结构，蛋白质通常在存在如十二烷基硫酸钠 (SDS) 等去污剂的情况下变性或分解为简单的初级结构，SDS 会使蛋白质带负电，从而允许适当的迁移。SDS 的结合量与蛋白质的大小成正比，因此该方法主要根据分子量分离蛋白质。二维 PAGE (2-D PAGE) 在第一个维度中通过等电点区分蛋白质，在第二个维度中通过分子量区分蛋白质。天然 PAGE 在不使蛋白质变性的情况下根据质量/电荷比分离蛋白质。
电泳通常在由琼脂糖或聚丙烯酰胺制成的基质或凝胶中进行。这些凝胶是化学惰性的，因此它们对分析物的干扰很小。琼脂糖是一种多糖，是从海藻中提取的。在任何特定凝胶中使用的琼脂糖浓度可能会有所不同。通常，凝胶中琼脂糖的浓度越高，孔径就越小。
为了分离蛋白质，使用聚丙烯酰胺（丙烯酰胺的交联聚合物）。为了避免氧气抑制聚合，将液体聚丙烯酰胺倒入玻璃板之间以制成凝胶板。聚丙烯酰胺的低浓度或其组成分子丙烯酰胺之间的交联较少会导致孔径较大的凝胶。标准蛋白质凝胶通常由两层组成，最上面一层称为堆叠凝胶，下面一层称为分离凝胶或分离凝胶。堆叠层含有低百分比的丙烯酰胺和低 pH 值。分离凝胶的丙烯酰胺浓度根据待运行的样品而异，其 pH 值高于堆叠凝胶。堆叠凝胶和分离凝胶之间 pH 值和丙烯酰胺浓度的差异可以提高分辨率并在分离凝胶中形成更清晰的条带。与琼脂糖凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶具有更高的分离能力。[1]
由于其不那么多孔的性质，丙烯酰胺凝胶经常用于分离 DNA、RNA、寡核苷酸和其他较小的分子。使用不同浓度的丙烯酰胺可以提供更厚或更薄的基质。与任何凝胶一样，凝胶的浓度或其成分的独特特征可能会影响分析物的迁移。
凝胶包含用于放置样品的孔，分析物从这些点开始迁移。一旦施加电流，分子标记将在凝胶的一侧或两侧运行以供以后比较，因为它将与样品一起迁移通过凝胶。覆盖凝胶的电泳缓冲液提供均匀的 pH 值并提供离子以支持电导率。当在凝胶上施加电流时，样品分子开始以不同的速率通过凝胶基质迁移，如果带正电则迁移到阴极，如果带负电则迁移到阳极。电压以及分配给特定运行的时间取决于凝胶的大小和待分析的样品类型。长时间运行电流可能会导致样品迁移出凝胶，而将电压调得过高可能会损坏样品或烧毁凝胶本身。[2]
分析物片段很少能用肉眼在凝胶中看到，因此必须对凝胶进行染色才能进行分析。分析物片段作为凝胶中的实心带解析。可以使用多种染料来观察带，包括溴化乙锭、银或考马斯亮蓝，具体取决于样品。可能使用的不太常见的染料包括荧光染料、锌和铜。染色时间可能从几个小时到几天不等，具体取决于凝胶类型和分析物类型。染料的分辨率也会有所不同。
染色完成后，可以用肉眼观察可视化。然而，使用紫外 (UV) 光通常更容易进行可视化。但是，此方法仅在所考虑的分子在 UV 光下发出荧光时才有效。[3]或者，如果样品分子包含放射性原子，则可以记录凝胶的放射自显影图。
带的分析包括将样品生成的带与已知蛋白质生成的带进行比较，无论是对照样品还是分子标记（标准）。可以通过去除包含感兴趣条带的凝胶的一部分来进行进一步的分析。凝胶内消化可以从较小的凝胶块中去除蛋白质，并允许直接操作分析物。凝胶分析通常很费时，而且很难获得清晰的条带，因为样品很少是纯净的。
维基百科还包含对凝胶电泳的相当详细的描述；有关更多信息，请点击这里.
- ^ “凝胶电泳原理。” http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/principles.html
- ^ Hames, B. D. 和 D. Rickwood。蛋白质凝胶电泳：实用方法。牛津大学出版社，1998 年。
- ^ “生物动画库。” http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/electrophoresis.html