蛋白质组学/蛋白质分离 - 离心/密度梯度离心
密度梯度在离心分离颗粒混合物以及亚细胞器和生物大分子的纯化中已变得几乎是常规操作。密度梯度方法的基本思想是，将待分离的颗粒混合物置于垂直液体柱的表面，该液体柱的密度从上到下逐渐增加，然后进行离心。尽管悬浮液中的颗粒都比梯度顶部的液体密度大，但样品的平均密度（即颗粒加上悬浮液）较低；只有在这种情况下，样品区才能由密度梯度的顶部支撑。密度梯度离心的两种主要类型是速率区带分离和等密度分离。
在速率区带分离中，颗粒根据其大小和质量进行分离。这意味着它们根据这些特性在梯度中迁移 - 如果将它们作为薄层铺在梯度的顶部，这将使它们分离成不同的区域或条带。这对于分离具有相同或非常相似密度但大小或质量不同的颗粒很有用：在确定颗粒在给定时间内迁移到哪里时，大小比密度更强的判别因素，因为颗粒在重力场中的沉降速率或速度与密度差成正比，但取决于直径的平方。
许多蛋白质和其他生物大分子，如抗体和病毒颗粒，都是以这种方式分离的。
通常情况下，速率区带分离是动态的而不是静态的：也就是说，如果离心时间足够长，所有区域最终都会变成一个沉淀物沉积在管子的底部。如果管中最大的密度（例如，10-50%（w/v）蔗糖梯度为 1.04 至 1.23 g/cm3）高于一个特定颗粒的密度，但低于其他正在分离的颗粒，则也可以将速率区带分离和密度分离相结合。
在等密度分离中，颗粒穿过溶剂梯度，直到到达其浮力密度等于梯度密度的点。这被称为等密度点或等密度位置。一旦颗粒到达其等密度点，它们将不再在梯度中移动，无论离心机继续运行多长时间。这种梯度的一个例子是氯化铯浓度梯度。例如，10%（w/v）溶液的密度为 1.08 g/cm3，50%（w/v）溶液的密度增加到 1.58 g/cm3。它和其他重金属盐存在一些毒性和产生非常强的渗透压的问题，以及化学影响某些生物大分子。还有其他更惰性的材料更适合等密度甚至速率区带分离，例如碘克沙醇：这是一种非离子聚合物，具有非常低的渗透压，并且能够像重金属盐一样自形成梯度。
选择尝试基于速率分离颗粒还是通过等密度带分离应考虑以下几点
- 对于像细胞器这样的较大颗粒，速率区带运行的持续时间比等密度运行短得多。当颗粒的长期活力或稳定性存疑时，这可能是一个重要的考虑因素。
- 速率区带运行通常在比等密度运行更浅的密度梯度中进行。这种条件可以证明对渗透活性颗粒的损害较小。
- 速率区带运行通常使用比等密度运行中使用的RFC更低的 RFC 进行。对于某些特别脆弱的颗粒，沉降过程中降低的流体动力剪切力可能有助于维持颗粒的完整性。
- 离心时间的长短在等密度运行中并不像在速率区带运行中那么关键。为了获得等密度带，需要一定的最小离心量，但如果样品铺在梯度的顶部，则超过此时间的延长离心时间不会过多改变结果。
- 一般来说，与速率离心相比，等密度梯度离心可以分离更多的颗粒。这是因为用于等密度运行的密度梯度更陡峭，并且更稳定地支持更大的样品量。
密度梯度不仅用于常规转子的离心管中的颗粒分离，还用于特殊用途的仪器，如区域转子、连续流转子和固定装置。密度梯度制备的基本原理在几乎所有应用中都是相同的，但目前讨论将集中在管中梯度的生成上。根据制备方法，密度梯度可以细分为两大类：阶梯梯度和连续梯度。
阶梯梯度是通过在离心管中依次分层不同密度的溶液，然后将待分馏的样品分层在最后一层“阶梯”上制备的。阶梯梯度有时在密度梯度离心中很有用，因为持续存在的急剧密度阶梯可以用作颗粒在离心中沉降的表面。这导致在每个阶梯处形成离散的颗粒层。
阶梯梯度的生产不需要特殊的密度梯度生成设备。梯度可以通过小心地将一层一层地分层在离心管中构建，从最密的层开始，使用移液器。或者，梯度可以通过使用细管将每一层沉积在离心管的底部开始形成，从密度最小的层开始。
连续密度梯度是指密度从一个极限或极端到另一个极限平滑且连续变化的梯度。可以通过允许足够的时间让扩散来平滑阶梯来从阶梯梯度生成这种梯度，但连续梯度通常是通过使用称为梯度发生器或梯度引擎的特殊装置直接制备的。
对于大多数生物学工作，用于产生密度梯度的理想溶质应满足以下标准
- 溶质应在水性介质中具有足够的溶解度以产生所需的密度范围。
- 溶质的溶解不应导致在所需密度范围内产生高粘度的溶液。粘性溶液对梯度发生器提出了特殊的混合问题，并且处理起来也比较困难。此外，颗粒的沉降速率与周围介质的粘度成反比下降。
- 溶质在所需的密度梯度范围内不应产生过高的渗透压。当这些颗粒通过密度梯度沉降时，如果周围介质的渗透压发生显着变化，则完整细胞、膜封闭的亚细胞器甚至大分子的大小、形状和密度都会发生改变。
- 梯度溶质的溶液应可调节至与待分离颗粒相容的pH值和离子强度。
- 溶质不应与待分离的颗粒发生反应，也不应干扰收集馏分的分析方法。
- 梯度溶质的溶液应表现出一种特性，该特性可以方便地用作浓度或梯度密度的量度。
- 溶质应易于从收集的梯度馏分中去除（如果需要或需要）。
- 溶质在所需数量下应价格合理。
离心结束后，密度梯度和缠结的颗粒区域通常从离心管（或转子）中取出并收集为一系列馏分。这可以通过多种方式实现。最古老和最简单的方法之一是刺穿每个离心管的底部，让内容物缓慢滴出。也可以通过小心地将一根狭窄的套管降低到管子的底部，并使用蠕动泵抽出梯度来去除梯度。在这两种方法中，梯度都以高密度端先离开管子，因此分离的颗粒按沉降速率或密度递减的顺序收集。第三种选择是在目标物质在梯度中的位置刺穿管子并手动提取。有关此内容的详细说明，请参阅http://people.rit.edu/rhrsbi/GEPages/LabManualPDF5ed/23%20Plasmid%20Prep.pdf中的协议。下图演示了质粒DNA馏分收集过程；但是，可以看出这很容易应用于蛋白质馏分。
由于溶液的密度是其质量与体积之比，因此在收集的梯度的连续等分试样中测量这两个参数可以揭示梯度的曲线。但是，这种方法很笨拙且耗时，很少与密度梯度离心结合使用。相反，测定从梯度的不同区域采集的小液滴的折射率，并从折射率与密度相关的表格或曲线中获得相应的密度。
当光从一种介质穿过另一种介质时，光速会发生变化。如果光以90度以外的任何角度穿过两种介质之间的界面，则光的方向也会发生变化。物质的折射率是衡量其弯曲光的能力的指标，并且与物质的密度有关。有关此主题的更多详细信息，请参阅维基百科上的斯涅尔定律。
下一节：差速离心
- "离心基础" 科尔帕默技术图书馆（经赛默飞世尔科技许可发布）。
- "BioChemika Ultra：密度梯度" 西格玛奥德里奇公司。
- Moedersheim，E. 等。"使用密度梯度方法的转子尾流可视化" 旋翼机空气动力学小组。
- Rothman，R。"基因工程实验手册：实验6 - 通过氯化铯密度梯度离心法大规模纯化质粒pRIT4501和pRIT4502" 罗切斯特理工学院。