细菌核糖体组装的结构生物化学/生物物理学研究
核糖体作为一种核糖核蛋白复合物，其关键功能之一是蛋白质合成。在超速离心过程中，细菌核糖体沉淀为70S颗粒，该颗粒由30S小亚基和50S大亚基组成。小亚基由16S核糖体RNA和21个核糖体蛋白组成，而大亚基由两个23S核糖体RNA和33个核糖体蛋白组成。小亚基主要负责在翻译开始和解码过程中与信使RNA结合，从而解析决定将哪个氨基酸插入多肽链的3-nt密码子。另一方面，大亚基充当肽酰转移酶中心，因此是肽键形成的位点。完整核糖体（包括30S亚基和50S亚基）的结构被解析，以确认核糖体实际上是一种核酶，并且催化位点确实位于核糖体RNA组分中。这些结构是确定翻译机制的关键因素，但关于核糖体如何组装成稳定的多组分复合体的信息仍然非常有限。核糖体组装是核糖体生成的中心，它涉及以下步骤
(1) 适当折叠核糖体RNA和核糖体蛋白
(2) 组装因子的结合和解离
(3) 核糖体蛋白的修饰和翻译
(4) 核糖体蛋白的结合
(5) 核糖体RNA的加工、修饰和转录
大多数这些步骤与核糖体RNA的转录同时进行，核糖体组装过程通过蛋白质结合事件和RNA构象变化进行。在这些事件中，核糖体蛋白的结合稳定了RNA折叠过程，并最终推动RNA结构达到最终的天然状态。总的来说，核糖体是一种重要的蛋白质结构，用于研究RNA的原理、RNA蛋白质识别、蛋白质折叠和多组分复合体的组装。组装错误的核糖体可能会导致疾病，因此研究核糖体生物合成可能为开发更有效的治疗疾病方法提供见解。对于科学家来说，了解完整核糖体的时间和物理途径至关重要，因为只有这样他们才能获得有关细菌核糖体组装过程中调控和可能发生的错误的知识。
细菌核糖体的结构由50多种蛋白质和三个大型结构域RNA分子组成。rRNA的修饰需要数十种基因产物，但这些修饰在核糖体功能中的作用尚不清楚，或者似乎并不重要。据信这些修饰是稳定RNA结构或RNA-蛋白质相互作用的一部分，介导翻译，或作为核糖体组装中的检查点。某些生物物理方法的发展有助于更好地了解细菌核糖体的构建方式以及其结构如何导致功能。核糖体组装不当会导致人体发生各种疾病，因为核糖体组装在细胞中起着重要的作用，例如RNA蛋白质识别。因此，了解核糖体组装是了解它们如何连接在一起的必要条件。研究核糖体如何调节有助于弄清楚组装生物合成中错误是如何以及为什么发生的。这三个贡献来自质谱、计算方法和RNA折叠研究。细菌核糖体的代谢有助于确保其他组分的正确和及时合成。由于核糖体是大型复杂的巨型分子，因此正确的产物非常重要，因此组装过程需要高效的步骤。下表显示了核糖体组装过程中发生的事件顺序，但不一定是严格的顺序。所有这些事件都必须发生，但途径可以是随机的，并且在自然界中有所不同。
据认为，细菌核糖体的组装通过一系列交替的RNA构象变化以及蛋白质结合事件进行。这些细菌核糖体的组装在体内比在体外快得多，效率也更高。
| 1) 核糖体RNA的转录 - rRNA作为单个转录本被转录。 2) 核糖体蛋白的合成 - 大约55种核糖体蛋白在转录和转录后基因调控机制中合成。 3) 核糖体RNA修饰 - 核糖体蛋白在大约30-40个特定位置被修饰，方法是碱基甲基化和/或假尿嘧啶化。组装的作用是稳定RNA结构或RNA蛋白质相互作用。 4) 核糖体蛋白修饰。 5) 核糖体RNA加工 - 生成成熟的rRNA 6) 核糖体RNA共转录折叠 7) 核糖体蛋白共转录结合 8) 组装因子结合和释放 - 在促进组装的有序高效过程的不同时间结合。
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随着可以轻松确定高分辨率核糖体结构的技术不断发展，过去几十年进行的实验研究在某种程度上被忽视了。这些研究没有专注于核糖体的结构，而是专注于确定核糖体的组成部分。在20世纪50年代后期，研究人员得出结论，核糖体的各种亚基组分实际上是同一颗粒的不同物理状态，这些状态受镁离子浓度的调节。Tissieres和Watson成功地证明，细菌核糖体由一个70S颗粒组成，该颗粒可以聚合形成100S颗粒，也可以分解成大亚基和小亚基。后来在20世纪60年代，Traub和Nomura取得了重大进展。他们证明，体外从游离的核糖体RNA和核糖体蛋白组装成活性30S亚基需要额外的组分。换句话说，核糖体RNA和核糖体蛋白拥有组装核糖体所需的所有信息。重组核糖体蛋白、体外转录的未修饰16S核糖体RNA以及与纯化蛋白结合的16S核糖体RNA可以重构成30S颗粒。此外，30S颗粒包含三个结构域，包括平台区域、头部和主体；该亚基的每个结构域都可以独立地重构成。此信息非常重要，因为它提出了通过简单地改变各种组分来观察核糖体组装过程的可能性。尽管早期研究中这种简单的观点对一些科学家来说似乎值得怀疑，但它为核糖体组装和生物合成的持续研究奠定了坚实的基础。
质谱与核糖体结合的三个主要应用是不同组分的清单、核糖体修饰的识别和核糖体动力学的分析。绘制修饰图的能力使科学家能够研究修饰在物种发育过程中的变化。这可以查明蛋白质修饰在组装或翻译中的具体作用。对分离的核糖体的分析是完全表征新物种修饰的唯一方法。核糖体修饰导致特定的基因型，而研究基因型可以暗示这种核糖体蛋白修饰在组装或翻译中发挥什么作用。iTRAQ质谱技术用于检查组装辅因子的突变。可以使用这种质谱法确定核糖体蛋白的分子量和序列。HDX应用揭示了结合的核糖体蛋白的哪个区域最灵活，因为这些区域在翻译步骤中很重要。
核糖体中大量的原子使得这种方法极具挑战性。通过这种方式，已经证明蛋白质结合位点的灵活性与蛋白质在该位点结合的阶段直接相关。一级结构蛋白在更刚性的位点结合，而二级和三级结构在更灵活的位点结合。此外，计算方法表明，组装的顺序是由静电结合引导的。这些能量直接反映了灵活性变化和静电变化。
生化方法提供了对组装过程中发生的一系列构象变化的深入理解。最快的折叠区域据说是发生在主要的蛋白质结合位点，这个结合位点是产生成熟的核糖体蛋白亚基所必需的。5’ 结构域快速自折叠的作用是在组装过程中共转录合成。通过使用含有 15 种核糖体蛋白子集的重组中间体 (RI) 可以组装并检查核糖核蛋白的构象变化，在低温下进行重组反应。RI 中间体的构象变化是通过加热发生的。然后形成新的结构 (RI*)，该结构具有结合剩余的五种蛋白质并形成 30S 亚基的能力。蛋白质结合反应的灵活性是由于 RNA 在不同温度下对探针的可及性存在差异。此外，由于中间的 RNA 折叠反应，蛋白质在不同时间结合到 rRNA 的不同区域。结合速率的温度依赖性。这确实揭示了每个核糖体蛋白结合的独特动力学障碍。
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