结构生物化学/细胞信号通路/一氧化氮和cGMP反应

一氧化氮（NO）作为一种重要的信号分子，在生物系统中起着重要作用。在哺乳动物生理学中，这种气体分子是环磷酸鸟苷（cGMP）通路中可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）的主要激活剂。当与一氧化氮合酶（NOS）结合时，NO的合成来自L-精氨酸和氧气（O2）。NO在扩散穿过细胞膜后，与sGC的亚铁血红素辅因子结合。因此，sGC只能与NO和一氧化碳（CO）形成稳定的结构，而不能与O2形成稳定的结构。sGC与NO的结合导致系统中cGMP水平的显着增加。然后，这种第二信使修饰磷酸二酯酶（PDE）、门控离子通道或cGMP依赖性蛋白激酶，以维持生理功能，例如血小板聚集、血管舒张和神经传递。为了在与NO/cGMP信号通路相关的疾病中进行治疗干预，许多研究集中在阐明sGC的激活/失活。本文总结了目前对sGC形式和功能的了解，以及NO信号传导的最新研究。

在20世纪80年代发现一氧化氮/环磷酸鸟苷（NO/cGMP）通路后，cGMP的产生随着有机亚硝酸盐（特别是硝酸甘油（GTN））的临床应用而刺激。这些化合物通过舒缓血管平滑肌，导致血管舒张，缓解心绞痛后的疼痛。在过去的几年里，研究人员关注这些化合物舒缓平滑肌的机制，这导致了NO作为信号分子的发现。此外，这也导致了合成NO和cGMP的酶的发现。

研究表明，哺乳动物组织的胞质和颗粒级分均表现出鸟苷酸环化酶活性。在这些颗粒级分中，膜结合颗粒鸟苷酸环化酶被钠尿肽激活（参考文献3和4中综述）。相反，胞质级分含有可溶性鸟苷酸环化酶（sGC），其被NO激活。NO反应性鸟苷酸环化酶活性也存在于某些组织（如骨骼肌和大脑）以及血小板（5-7）的细胞膜中。大多数组织含有鸟苷酸环化酶，而这些组织中的蛋白质分布是同种型特异性的。由于信号化合物局部群可以在特定类型的组织内合成，并且靠近可溶性或膜结合的cGMP受体，这为调节cGMP依赖性反应提供了另一个理由。因此，特定组织可以通过表达独特的GC同种型来控制cGMP水平，这些同种型具有不同的肽受体/配体激活剂。此外，在人和小鼠血管稳态（8）中，颗粒鸟苷酸环化酶和sGC之间存在相互交流。这些两个通路之间的交流很可能是通过涉及cGMP的几个过程来实现的。在真核生物中，NO信号传导以钙的初始释放为标志，然后钙/钙调蛋白复合物与一氧化氮合酶（NOS）结合，导致酶被激活。然后，在NO合成后，它扩散到靶细胞并与sGC中的亚铁血红素结合。sGC是一种组氨酸连接的血红蛋白，它与NO和一氧化碳（CO）结合，但不与氧气（O2）结合。结果，cGMP合成增加了数百倍。

随着时间的推移，用于cGS纯化的经济高效技术的开发进展甚微，但已经开发了几种技术来产生大约微克的均质产品。主要来自大鼠和牛组织的cGS提取。在20世纪80年代，从大鼠肺、肝脏以及牛肺中获得了用于研究的纯化sGC。无论如何，人们观察到，sGC可以不含亚铁血红素辅因子而被纯化，具体取决于纯化方法。使用硫酸铵沉淀和增溶剂会导致蛋白质合成错误折叠。这种错误折叠蛋白质的亚铁血红素重建会产生一种独特的sGC，其生化特性与天然蛋白质不同。目前，牛肺sGC方法是从源组织中分离亚铁血红素结合蛋白的最有效和最有效的方法。对于每公斤肺，这些蛋白质产量为1毫克。在进一步的进展中，sGC的生产从重组sGC表达的异源表达系统的进展中得到提升。COS-7细胞被用作第一个成功的异源表达系统。尽管COS-7细胞中的sGC产量很低，但还是成功地建立了sGC作为包含α1和β1亚基的专性异二聚体。此外，COS-7细胞被用于通过裂解物活性测定来检查sGC的截断和突变。第一个分离纯重组蛋白的程序是在Sf9/杆状病毒表达系统中过表达大鼠sGC。sGC在昆虫细胞中的表达在没有亲和标签的情况下取得了成功，但最近的技术需要一个His标签来完成纯化过程。大多数蛋白质是不溶的。从这种方法中，每升培养液可获得0.2-0.4毫克纯可溶性蛋白质。迄今为止，这已成为获得每升培养液中纯化的纯蛋白质的大鼠和人类的常用方法。另一种使用大肠杆菌表达系统的方法用于异二聚体，天蛾（Manduca sexta）。它产生的（0.5-1.0毫克/升）仅是部分纯化的全长蛋白质。使用α1和β1亚基C端截断获得了更高的产量。虽然由此产生的异二聚体蛋白不能使GTP环化，但它们仍然可以被纯化到均质性。

异二聚体sGC的结构包含两个同源亚基，α和β。大多数研究集中在同种型α-一β-一蛋白质上，尽管也发现了α-二和β-二亚基。最初，这些蛋白质只存在于哺乳动物中，但也存在于果蝇（Drosophila melanogaster）和天蛾（M. sexta）等昆虫中，以及鱼类中。在哺乳动物、人类、大鼠和牛中，已经研究了α和β亚基的定位。通过蛋白质印迹和定量聚合酶链反应分析技术，α-二亚基的含量低于α-一和β-一对应物。它在脑、结肠、心脏、脾脏、肺、胎盘和子宫中高度存在。研究表明，通过纯化的蛋白质，α-二β-一异二聚体具有与α-一β-一异二聚体完全相同的配体结合特性，但α-二亚基的剪接变异体与β-一亚基结合形成二聚体，形成化学惰性复合物。

目前，几项针对小鼠的研究表明了各种sGC同种型对生理功能的重要性。似乎缺乏sGCβ-一亚基的小鼠表现出高血压、心率低和胃肠道收缩障碍。此外，在平滑肌细胞中去除β-一亚基会导致这些细胞中蛋白质的丢失，就像敲除小鼠中的高血压一样。一般来说，β-一亚基的缺失往往被视为全局sGC敲除，因为α-一和β-一与β-二不兼容异二聚体。sGCα-一和α-二敲除小鼠也得到了制备。在这里，两种蛋白质都被发现对长期增强和血管舒张至关重要，即平滑肌组织中血管的收缩。研究表明，α-一亚基缺陷型小鼠的两种α亚基都参与了结肠组织的参与。

参考文献

可溶性鸟苷酸环化酶的结构和调节。Derbyshire ER, Marletta MA. Annu Rev Biochem. 2012;81:533-59. Epub 2012年2月9日。评论。