结构生物化学/色谱/薄层
薄层色谱 (TLC) 是一种在有机实验室中非常有价值的技术。它用于分离混合物，检查混合物的纯度，或监测反应的进展。溶质的极性、溶剂的极性和吸附剂的极性是决定化合物在 TLC 板上迁移率的关键因素。该技术有助于根据不同混合物的迁移率差异来分离它们。TLC 也可以通过将其与已知化合物进行比较来识别化合物。
薄层色谱 (TLC)：该技术用于使用液体溶剂（流动相）和涂有硅胶（固定相）的玻璃板来分离干燥的液体。基本上，我们可以在 TLC 中使用任何有机物质（纤维素聚酰胺、聚乙烯等）或无机物质（硅胶、氧化铝等）。这些物质必须能够分解并形成均匀的层。在板的表面上，将有一层非常薄的硅胶，被认为是固定相。然后，在宽口容器（例如烧杯或展开缸）中加入少量溶剂，足以覆盖容器的底部。将制备好的 TLC 板放入密封的容器中，其中含有少量溶剂（移动相）。由于毛细作用，溶剂向上移动到板子上，现在我们可以取出板子并分析 Rf 值。
通常 TLC是在涂有硅胶、氧化铝或纤维素的玻璃、塑料或铝板上进行的。这种涂层称为固定相。然后将样品涂抹到板的底部，并将板放入溶剂或流动相中。毛细作用将样品推到板子上方。样品在板上移动的速度取决于样品与固定相结合的紧密程度。这是由极性决定的。然后比较 Rf 值或保留因子进行分析。溶质的阻滞因子定义为化合物移动距离与溶剂在给定时间内移动距离的比率。因此，Rf 值将从最小值 0.0 到最大值 1.0 不等。然而，对于给定的蛋白质化合物，这种阻滞因子会随着所用吸附剂和/或溶剂的变化而有很大差异。此外，阻滞因子会随着吸附剂中水分含量的变化而有很大变化。然后比较 Rf 值或保留因子进行分析。这个 Rf 值可以量化为
Rf =（化合物移动的距离）/（溶剂移动的距离）
在板的底部大约 7 毫米处用铅笔画一条线，并在该线上放置一滴染料混合物溶液。为了显示液滴的原始位置，必须用铅笔画线。如果用墨水画线，墨水中的染料会与染料混合物一起向上移动到 TLC 板上，结果将不准确。为了获得更准确的结果，用染料混合物在 TLC 纸上点几次，试图积累材料而不扩大斑点。直径为 1 毫米的斑点将提供良好的结果。在点 TLC 板时，确保不要将混合物点得彼此太近，因为当染料混合物向上移动到 TLC 板时，它会与其他斑点发生碰撞，而 Rf 值将难以计算。
当斑点变干后，将 TLC 板放入烧杯中，溶剂液面低于铅笔线。盖住烧杯以确保烧杯中的大气层饱和有溶剂蒸汽。用浸泡在溶剂中的滤纸在烧杯内衬，因为这将有助于分离混合物。用溶剂蒸汽饱和烧杯中的大气层可以阻止溶剂在向上移动时蒸发。
当溶剂慢慢地向上移动到板子上时，染料混合物的不同组分以不同的速率移动，混合物被分离成不同的彩色斑点。让溶剂继续上升，直到它大约距离板的顶部 1-1.5 厘米。这为这种特定的溶剂和固定相组合提供了染料组分的最大分离。
一旦诱导了这种特定溶剂和固定相溶剂的染料组分的最大分离，将 TLC 板从烧杯中取出并使其干燥。在取出 TLC 板后立即，在溶剂开始蒸发之前，用铅笔标记溶剂前沿。溶剂前沿是溶剂在 TLC 板上上升到的线。然后，让溶剂从 TLC 板上蒸发。用圆圈/标记分离的化合物以指示它们在板上的位置。在某些情况下，向上移动到 TLC 板上的化合物用肉眼观察时没有明显的出现。在这种情况下，可以将 TLC 板短暂地浸入包含某些试剂的显色溶液中，这些试剂将与分离的化合物反应，在加热后形成有色化合物。另一种可视化 TLC 板上分离的无色有机化合物的方法是将它们置于碘化物 (I2) 蒸气中以测试其对碘化物蒸气的吸收。将这些带有无色标记的 TLC 板放入通过在密闭罐中放置少量碘晶体而制备的碘蒸气浴中。在将 TLC 板放入浴中大约 10 分钟后，无色斑点逐渐变成深棕色。由于彩色斑点通常在短时间内消失，因此在将 TLC 板从碘浴中取出后立即用铅笔将其勾勒出来。
除了碘浴显色技术外，荧光指示剂也可以帮助确定分离的化合物移动的距离。在黑暗的房间/区域中，使用短波紫外灯照射板的吸附剂侧。许多化合物会降低荧光的强度。使用这种紫外光显色技术，分离的化合物在荧光 TLC 板上显示为暗点。在 365 纳米光下，通常更容易看到变暗的斑点。在紫外光源下用铅笔勾勒出这些暗点，以永久记录分析化合物移动的位置。
紫外光下 TLC 板解释的一些示例
1. TLC 提供有用的定性结果和解释。例如，如果一个人想将未知混合物中的组分与标准化合物 A 和 B 进行比较，则可以进行 TLC，如果未知物在紫外光下的暗点与化合物 A 和 B 的暗点一致，则未知物包含 A 和 B。
2. 如果未知物只有一个暗点，并且不确定化合物 A 的斑点是否与未知物的斑点处于同一水平，则可以将两种化合物在 TLC 板上共同点样以快速检查。共同点样是指将化合物 A 点样在 TLC 板的一个区域，并将未知物点样在与化合物 A 的斑点相同的区域。如果共同点样泳道在紫外光下只有一个暗点，则未知物的身份是 A。
示例 1 的共同点样结果应该只包含 2 个斑点，其中一个斑点代表化合物 A + 未知物中的一个组分，另一个斑点代表未知物混合物中的另一个组分。额外的斑点可能表明未知物中的一个组分与标准不匹配。
3. 如何才能判断 A+B 之间的反应实际上发生了，从而得到新的产物 C？可以使用 TLC 进行检查。化合物 A 和 B 分别点样在 TLC 板上。然后将 A+B（C）的混合物点样在 TLC 板上，并且在每次时间段后都可以点样新的样品（C2、C3 等）。
C1 上的两个斑点与 A 和 B 对齐，表明这仅仅是 A+B 的混合物，而不是新的产物。C2 和 C3 仍然有一个斑点与反应物 A 对齐，但 C4 有两个斑点与任何反应物都不匹配，而 C5 只有一个暗点。有两个可能的解释
1) C2 到 C4 是 C5 中新产物的中间体。
2) 所需的产物实际上是 C4，并且它会降解，最终在板上只有一个组分。
- 实验室中的技巧
1) 使用毛细管将溶液转移到 TLC 板上。较小的原点斑点将产生较小的区域，并在紫外光下更好地分离暗点，这将使 Rf 的计算更容易和更准确。
2) 含有 TLC 板和溶剂的容器应始终放在平面上，以便获得用于运行的“直线泳道”。
您可能已经知道， TLC 板由硅胶制成，硅胶是一种极性化合物，这就是非极性化合物在 TLC 板上往往具有更大分离的原因。
如示意图所示，最初使用的溶剂由正己烷和乙酸己酯按 7:3 的比例混合。这意味着与 TLC 板反应的溶剂中大部分是非极性的。由于溶剂缺乏极性，样品和 TLC 板之间竞争性较弱，因此样品的极性部分会更容易与硅胶发生反应，导致分离效果较差。由于没有东西阻止样品与硅胶反应，它会立即反应并导致分离效果较差。想象一只狗沿着小路行走，如果它每遇到一棵树就停下来闻一闻，它与起点的距离会比它一直走而不被周围环境分散注意力要短。对于这些样品也是如此，如果它们在移动过程中不断与硅胶发生反应，它们就不会移动太远。
当比率改变，乙酸己酯（更极性）的比例增加时，突然之间就出现了竞争性反应。样品想要与 TLC 板发生反应，但溶剂（由于它现在更极性）也想要反应，因此样品与 TLC 板之间的反应会减少。显然，溶剂正在尝试与 TLC 板发生反应，导致样品没有太多机会“停下来闻一闻”，因此它被分离得更远。样品与 TLC 板的反应减少是因为现在溶剂也与相同的 TLC 板发生反应，这解释了为什么分离效果更好。
图中的第三种 TLC 板有点棘手。有人可能会认为石油醚由于名称（它含有醚）而具有半极性，但实际上石油醚是一种非极性化合物，由许多烃分子组成。这不会导致分离效果有任何差异。