结构生物化学/克隆技巧
< 结构生物化学
克隆过程中的一些一般性考虑因素可以提高克隆效率。以下是一些技巧：
1. 应该直接纯化用适当的限制性内切酶消化的 DNA 插入片段/PCR 产物和载体，或者从琼脂糖凝胶中纯化。这去除了不感兴趣的引物或限制性片段。
2. 在进行连接时，应该测试插入片段与载体的比例以找到最佳条件。通常，1:1 或 3:1 的比例效果很好。
3. 筛选含有插入了感兴趣 DNA 的载体的正确克隆非常重要。应用常见的筛选方法，例如 β-半乳糖苷酶活性的蓝白筛选和抗生素筛选。
4. 小牛肠碱性磷酸酶是一种水解酶，负责从核苷酸、蛋白质等中去除磷酸基团。这种酶可以在用限制性内切酶消化后使用。
5. 连接需要 ATP。
6. 酶用于以受控的、通常是确定的方式合成、降解、连接或去除核酸的部分。
7. 克隆酶，是核酸克隆程序中重要的酶。一些克隆酶用作连接酶、激酶和磷酸酶，以及 RecA 蛋白。
8. 当使用具有抗生素抗性特性的载体进行选择时，在转化细胞后，让细胞在适当的培养基和培养温度下生长几个小时，可以提高生长效率和抗生素抗性。这将允许成功摄取克隆载体的细胞在接种到抗生素处理的培养皿中后更容易收集。溶液中的初步生长阶段将刺激细胞活性，从而产生抗生素抗性特性。
9. 当使用具有相似抗生素选择的多個克隆的 DNA 載體時，交叉污染是一個令人擔憂的問題。清洗、用乙醇處理和火焰滅菌儀器是必須認真採取的重要防交叉污染措施。
10. 无菌操作技术。