结构生物化学/原核生物基因表达调控
原核生物在应对环境变化时最常用的方法是改变其基因表达。表达是指基因被转录成 RNA，然后翻译成蛋白质。两种类型的表达是组成型表达，其中基因不断表达，以及调节型表达，其中细胞内需要满足特定的条件才能表达基因。本小节重点介绍原核生物如何调节其基因的表达。
转录，即 DNA 转换为 RNA，是控制基因活性的第一步。蛋白质与 DNA 序列相互作用以促进或阻止基因的转录。
请记住，就具有调控系统能够识别的特征而言，DNA 序列彼此无法区分。因此，在调节基因表达时，原核生物依赖其基因组中的其他序列，称为调控位点。这些调控位点通常也是 DNA 结合蛋白结合位点，并且在原核生物中靠近用于转录的 DNA。
大肠杆菌中的一个调控位点示例：当将乳糖引入细菌的环境中时，编码产生β-半乳糖苷酶的基因开始表达。这种酶的功能是加工乳糖，以便细胞可以从中提取能量和碳。
此调控位点（如图所示）的核苷酸序列显示几乎完全反转的重复。这表明 DNA 具有近乎两倍的对称轴，这通常与与该位点结合的蛋白质的对称性相关。在研究蛋白质-DNA 相互作用时，通常存在对称性。
进一步研究 lac 调控位点和发生在那里的蛋白质-DNA 相互作用，科学家们观察了识别 lac 位点的 DNA 结合单元与该位点本身（它是较大寡核苷酸的一部分）形成的复合物的结构。他们发现，lac 调控位点特异性的 DNA 结合单元来自 lac 阻遏蛋白。正如其名称所暗示的那样，lac 阻遏蛋白的功能是抑制乳糖加工基因的表达。这种 DNA 结合单元的二倍对称轴与 DNA 的对称性相匹配，并且该单元以二聚体的形式结合。来自蛋白质每个单体的 α 螺旋插入到 DNA 的主沟中。在这里，氨基酸侧链（通过高度位点特异性的氢键）与暴露的碱基对相互作用，以至于 lac 阻遏蛋白只能非常紧密地结合到大肠杆菌基因组中的这个特定位点。
在确定许多原核生物 DNA 结合蛋白的结构后，在许多蛋白质中观察到的一个结构模式是成对的 α 螺旋，由一个紧密的转角隔开。这些被称为螺旋-转角-螺旋基序，由两个不同的螺旋组成：第二个 α 螺旋（称为识别螺旋）位于主沟中，并与碱基对相互作用，而第一个 α 螺旋主要与 DNA 骨架接触。
回顾之前关于大肠杆菌和β-半乳糖苷酶的例子，我们可以了解 DNA 结合蛋白如何进行调控的共同原则。当大肠杆菌的环境中缺乏葡萄糖（它们的主要碳和能量来源）时，细菌可以通过β-半乳糖苷酶将碳源切换为乳糖。β-半乳糖苷酶将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，然后被细胞代谢。渗透酶促进乳糖穿过细菌细胞膜的运输，是必不可少的。另一方面，转乙酰酶不是乳糖代谢所必需的，但它在解毒渗透酶也可能运输的化合物方面发挥作用。这里我们可以说，一组共同有助于适应细胞环境变化的酶的表达水平会一起变化。
在大肠杆菌中，在有葡萄糖或甘油等碳源的环境中生长的大肠杆菌，其体内大约有 10 个或更少的β-半乳糖苷酶分子。然而，当细菌在乳糖上生长时，这个数字会猛增到几千个。仅乳糖的存在就会通过促进新酶的合成而不是激活前体来大幅增加β-半乳糖苷酶的数量。
在弄清楚这种特定情况下基因调控的机制时，观察到另外两种蛋白质半乳糖苷渗透酶和硫代半乳糖苷转乙酰酶与β-半乳糖苷酶一起合成。
β-半乳糖苷酶、转乙酰酶和渗透酶协同调节的事实表明，一种共同的机制控制了编码所有三种的基因的表达。弗朗索瓦·雅各布和雅克·莫诺提出了一个名为操纵子模型的模型来解释这种平行调节和其他观察结果。操纵子模型的三个遗传部分是（1）一组结构基因，（2）一个操纵子位点（一个调控 DNA 序列），以及（3）一个编码调控蛋白的调控基因。
为了抑制结构基因的转录，调控基因编码一种用于与操纵子位点结合的阻遏蛋白。在乳糖操纵子的情况下，阻遏蛋白由 i 基因编码，i 基因与 o 操纵子位点结合以阻止 z、y 和 a 基因（编码 β-半乳糖苷酶的三种结构基因）的转录。操纵子上还有一个启动子位点 p，其功能是将 RNA 聚合酶引导到正确的转录起始位点。当转录时，所有三个结构基因都会产生一个编码β-半乳糖苷酶、渗透酶和转乙酰酶的单一 mRNA。因为这种 mRNA 编码多个蛋白质，所以它被称为多顺反子（或多基因）转录本。
在没有乳糖的情况下，lac 阻遏蛋白与操纵子结合并阻止转录
lac 阻遏蛋白（如图所示与 DNA 结合）是一种四聚体，具有氨基末端和羧基末端结构域。氨基末端结构域是与 DNA 结合的结构域，而羧基末端结构域形成一个独立的结构。如图所示的两个亚基合并形成 DNA 结合单元。当细菌环境中没有乳糖时，lac 阻遏蛋白紧密且迅速地与操纵子 DNA 结合（与基因组中的随机位点相比，与操纵子的结合力强 4x10^6 倍）。阻遏蛋白的结合阻止 RNA 聚合酶转录启动子位点下游的 z、y 和 a 基因，这些基因编码三种酶。lac 阻遏蛋白与操纵子形成的复合物的解离常数约为 0.1 pM，缔合速率常数高达 10^10 M-1s-1。这表明阻遏蛋白通过沿着 DNA 分子扩散来寻找操纵子，而不是通过与水介质的相遇。
就 lac 阻遏蛋白的 DNA 结合偏好而言，其特异性水平非常高，以至于它在大肠杆菌基因组中可以被称为几乎唯一的位点。当氨基末端结构域的二聚体与操纵子位点结合时，羧基末端结构域的二聚体能够附着在距主要操纵子位点 500 bp 内的两个位点之一，这两个位点近似于操纵子的序列。每个单体通过螺旋-转角-螺旋单元与结合的 DNA 的主沟相互作用。
现在我们来看看乳糖的存在如何改变阻遏物的行为以及操纵子的表达。所有操纵子都有诱导物——促进操纵子内基因表达的触发因素——而乳糖操纵子的诱导物是异乳糖，它是由半乳糖和葡萄糖以α-1,6键连接形成的分子。
在β-半乳糖苷酶反应中，异乳糖是一种副产物，当细菌中β-半乳糖苷酶的含量很低时，它以低水平产生。此外，虽然不是酶的底物，但异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) 是一种强大的 β-半乳糖苷酶表达诱导剂。
在乳糖操纵子中，诱导物促进基因表达的方式是抑制乳糖阻遏物与操纵子结合。它通过与乳糖阻遏物本身结合来抑制，从而极大地降低了阻遏物与操纵子 DNA 结合的亲和力。诱导物在每个单体的大结构域中心结合，导致阻遏物 DNA 结合域的构象变化。这些变化极大地降低了阻遏物的 DNA 结合亲和力。
原核生物中许多其他基因调控复合体功能类似于乳糖操纵子。另一个类似网络的例子是参与嘌呤（以及在一定程度上嘧啶）合成的网络。这些基因受到嘌呤阻遏物的抑制，嘌呤阻遏物与乳糖阻遏物的序列一致性为 31%，具有相似的 3D 结构。然而，在这种情况下，嘌呤阻遏物的行为与乳糖阻遏物相反：它只有在与一个小分子称为辅阻遏物（鸟嘌呤或次黄嘌呤）结合时，才会通过与特定 DNA 位点结合来阻止转录。
虽然之前提到的 DNA 结合蛋白都是通过阻止 DNA 序列的转录直到环境中满足某些条件才发挥作用，但也有 DNA 结合蛋白的例子实际上促进转录。
大肠杆菌中的分解代谢激活蛋白就是一个很好的例子。当细菌在葡萄糖中生长时，它含有很少量的分解代谢酶，这些酶的功能是代谢其他糖。编码这些酶的基因实际上受到葡萄糖的抑制，这种效应被称为分解代谢阻遏。葡萄糖降低 cAMP（环状 AMP）的浓度。当 cAMP 的浓度高时，它会刺激用于分解其他糖的这些分解代谢酶的转录。这就是分解代谢激活蛋白（CAP 或 CRP，cAMP 受体蛋白）发挥作用的地方。CAP 与 cAMP 结合后，会刺激阿拉伯糖和乳糖分解代谢基因的转录。CAP 仅与特定 DNA 序列结合，作为二聚体结合到相对于转录起始位点 -61 位置的倒位重复序列上，与 RNA 聚合酶结合的位置相邻（如图所示）。
这种 CAP-cAMP 复合物通过使 RNA 聚合酶和 CAP 之间的接触在能量上变得有利，将转录提高了约 50 倍。在大肠杆菌基因组中有多个 CAP 结合位点，因此增加细菌环境中 cAMP 的浓度将导致这些 CAP-cAMP 复合物的形成，从而导致编码各种分解代谢酶的许多基因的转录。
在研究基因调控网络及其功能时，对细菌病毒的研究——尤其是 λ噬菌体——非常有价值。λ噬菌体能够通过溶菌途径或溶原途径发展。在溶菌途径中，病毒基因组中的大多数基因进行转录，导致大量病毒颗粒的产生（约 100 个）以及细菌的最终裂解。在溶原途径中，细菌 DNA 将病毒基因组整合到自身中，大多数病毒基因保持不表达；这使得病毒遗传物质能够在细菌的复制中携带。病毒基因组中存在两种必需蛋白和一组调控序列，它们是两种途径选择之间转换的原因。
λ 阻遏物是这些关键调控蛋白之一，当阻遏物的含量低时，它会促进编码阻遏物的基因的转录。当阻遏物的含量高时，它会阻止基因的转录。它也是一个自调控蛋白。虽然 λ 阻遏物与 λ 噬菌体基因组中的许多位点结合，但这里相关的位点是右侧操纵子，该操纵子包括 3 个 λ 阻遏物二聚体的结合位点，以及大约 80 个碱基对区域内的 2 个启动子。第一个启动子的作用是驱动 λ 阻遏物基因的表达，而另一个启动子负责驱动各种其他病毒基因的表达。λ 阻遏物与第一个操纵位点结合的亲和力最高；当它与第一个操纵位点结合时，蛋白与相邻操纵位点结合的可能性会增加 25 倍。当第一个和第二个操纵位点结合了这些复合物时，λ 阻遏物二聚体抑制了编码 Cro 蛋白（阻遏物和其他蛋白的控制者）的相邻基因的转录。第二个操纵位点的阻遏物二聚体可以与 RNA 聚合酶相互作用，从而刺激控制编码 λ 阻遏物的基因的转录的启动子的转录。这就是 λ 阻遏物促进自身产生的方式。λ 阻遏物融合可以用来研究大肠杆菌中的蛋白-蛋白相互作用。λ 阻遏物中有两个不同的结构域：N 末端（DNA 结合活性）和 C 末端结构域（二聚化）。为了获得活性阻遏物融合，应将 C 末端结构域替换为异源二聚体结构域，并形成二聚体或更高阶的寡聚体。然而，非活性阻遏物融合不能与 DNA 序列结合，从而影响噬菌体或报告基因的表达。[1]
我们可以在上图中看到 λ 阻遏物如何通过与第一个操纵位点结合（具有最高的亲和力）来阻止 Cro 的产生。同时，Cro 通过与第三个操纵位点结合（具有最高的亲和力）来阻止 λ 阻遏物的产生。整个回路是决定溶菌途径还是溶原途径的决定性因素：如果 λ 阻遏物高，而 Cro 低，则选择溶原途径；如果 Cro 高，而 λ 阻遏物低，则选择溶菌途径。
一些原核生物也已知会经历一个过程，在这个过程中它们会释放称为自诱导物的化学物质到它们的培养基中（群体感应）。这些自诱导物，通常是酰基高丝氨酸内酯，会被周围的细胞吸收。当这些自诱导物的水平达到一定程度时，受体蛋白会与它们结合并激活几个基因的表达，包括那些促进合成更多自诱导物的基因。这是一种原核生物之间进行化学相互作用以改变其基因表达模式的方式，具体取决于其培养基中周围细胞的数量。进行这些群体感应机制的原核生物群落被称为生物膜。
虽然大多数基因表达调控发生在转录起始阶段，但转录的其他步骤也是调控的可能目标。
涉及结构基因突变的突变体是色氨酸营养缺陷型，需要色氨酸才能生长。为了将前体分子莽草酸转化为色氨酸，trpE、trpD、trpC、trpB和trpA基因编码一个多顺反子信息，而mRNA将被翻译成执行转化的酶。
第二种类型的突变体能够组成性地合成色氨酸合成所需的酶。trpR基因编码色氨酸阻遏蛋白。该基因与trp操纵子相比，位于大肠杆菌染色体上的另一个象限。trpR基因无法有效地调节色氨酸的合成。对二聚体trp阻遏蛋白的研究表明，它不能单独发挥作用。阻遏蛋白必须与该代谢途径的最终产物结合，才能调节色氨酸的合成。因此，色氨酸是自身生物合成的协阻遏物。这个过程被称为转录水平的反馈抑制。
当色氨酸浓度足够高时，阻遏蛋白与色氨酸结合形成阻遏蛋白-色氨酸复合物。该复合物将附着在trp操纵子的操纵子区域，阻止RNA聚合酶结合并启动结构基因的转录。此外，当细胞中色氨酸浓度低时，由于缺乏色氨酸-复合物，RNA聚合酶能够与基因结合并转录结构基因。因此，色氨酸将被生物合成。[2]
衰减是原核生物通过调节新生RNA二级结构来调节转录的一种机制。
[edit | edit source]在研究色氨酸操纵子的过程中，查尔斯·雅诺夫斯基发现了另一种转录调控方式。trp操纵子编码5种将莽草酸转化为色氨酸的酶，在检查trp mRNA的5'端时，他发现第一个酶的起始密码子之前有一个包含162个核苷酸的引导序列。他的下一个观察是，当色氨酸水平高时，只有前130个核苷酸被生产成转录本，但当色氨酸水平低时，会产生包含整个引导序列的7000个核苷酸trp mRNA。这种调控方式被称为衰减，其中转录在产生任何编码酶的mRNA之前就被切断了。
衰减取决于mRNA的5'端特征。序列的第一部分编码一个包含14个氨基酸的引导肽。衰减器位于该肽的开放阅读框之后 - 它是一个能够形成一些替代结构的RNA区域。因为细菌的转录和翻译是紧密耦合的，所以说trp mRNA的翻译在合成核糖体结合位点后不久就开始。
mRNA的结构因核糖体而改变，而核糖体因缺乏引导mRNA翻译所需的氨酰基-tRNA而停滞。这使RNA聚合酶能够在衰减器位点之后转录操纵子。
参考文献
[edit | edit source]- ↑ Leonardo Mariño-Ramírez, Lisa Campbell, and James C. Hu. Screening Peptide/Protein Libraries Fused to the λ Repressor DNA-Binding Domain in E. coli Cells. 2003; 205: 235–250.
- ↑ Arkady B. Khodursky, Brian J. Peter, Nicholas R. Cozzarelli, David Botstein. DNA microarray analysis of gene expression in response to physiological and genetic changes that affect tryptophan metabolism in Escherichia coli. 2000 October 24; 97(22): 12170–12175. Published online 2000 October 10.