结构生物化学/使用荧光显微镜计数蛋白质
两种计数蛋白质分子的方法被广泛使用：逐步光漂白和与荧光标准的比率比较。
荧光发生在光被吸收后从荧光团发出光，而GFP能够在没有酶促修饰或辅因子的情况下发出荧光，这允许单个基因在任何生物体中表达可检测到的发射。 计数活细胞中蛋白质分子的数量使研究人员能够确定功能性蛋白质复合物的化学计量，并寻求细胞结构模型。 由于全基因组研究可能无法识别有关低丰度蛋白质或局部蛋白质浓度的信息，因此单分子技术如果成功，将能够解决这个问题。
逐步光漂白是荧光显微镜计数蛋白质分子的方法之一，它“依赖于荧光蛋白 (FP) 反复暴露于光源导致的不可逆和随机荧光损失。” 样品将持续暴露于低强度的激发光，以使样品“缓慢漂白，直到其发射强度达到背景水平。” 结构中存在的荧光分子数量决定了合适的激发光强度和曝光时间。 由于会显示出大约是其他步骤两倍大小的步骤，因此需要尽量减少漏漂白事件。 漂白方法仅适用于低蛋白质数量，因为漏漂白事件的概率随着结构中分子数量的增加呈指数增长。 “Das 等人估计，在没有数学外推的情况下，最多可以检测到 15 个漂白步骤，尽管他们在实验中只检测到 7 个步骤。” 使用数学辅助工具，通过光漂白可以计数的分子最大数量可以增加到大约 30 个分子。 需要进行背景校正以消除来自扩散蛋白的荧光并校准初始强度。 在光漂白过程中，应选择感兴趣区域 (ROI) 以避免混淆多个结构。 由于原始数据存在噪声，因此还必须过滤数据以揭示离散下降。 例如，Chung-Kennedy 滤波器是用于定量细菌复制体的最常用的滤波器。 “它计算一个光漂白 ROI 数据中两个连续集中数据的均值和标准差，并报告标准差较低的集的均值。” 数据集中的平均数据点数应该足够大以减少噪声，但又足够小以确保不会漏掉几个步骤。
此方法涉及测量蛋白质样品与标准品的荧光强度的比率。 它使用一系列表达蛋白质样品或标准品的细胞图像，这些细胞通过与 FP 融合获得了荧光特性。 “如果标准品可以与感兴趣的蛋白质区分开来，则最好在同一张载玻片上包含表达标准品和实验融合蛋白的细胞，以确保照明的可比性。 如果标准品不可区分，则可以连续拍摄图像，或者可以使用另一个标记物单独成像以区分远处对照细胞，从而消除福斯特共振能量转移。” 此方法的优点是能够计数相对较多的蛋白质分子。 需要进行校正以获得更准确的测量结果。 例如，如果使用整个视野，则需要校正显微镜系统中不均匀的照明。 此外，如果样品分子相对于盖玻片的深度不同，则应使用荧光珠对深度对强度影响进行校准。 可以使用不同的曝光时间来控制信噪比并避免饱和。 激发强度应保持恒定，以避免由于闪烁分子导致的光子计数发生非线性变化。 “除非存在重叠的相邻信号或不均匀的细胞质强度，否则应从同心区域获取背景。” 使用可靠的标准对于这种方法非常重要。 当比较不同大小的蛋白质或结构相同但强度差异很大的蛋白质时，应使用多个 z 截面的强度总和。 应使用基因组 DNA 测序等方法进行额外的验证，以确保所测量的数字的准确性。 使用比率方法可以获得每个蛋白质的分子数量及其相对化学计量，这可以在一个或多个时间点获得。
应使用基因编码的 FP，以产生与蛋白质样品 1:1 的化学计量，这可能会影响成熟效率或未折叠 FP 的比例。
研究人员应使用最佳可用的 FP，以最大限度地提高信噪比，特别是对于丰度较低的蛋白质。 在构建融合蛋白之前，应考虑用于融合的 FP 的折叠和成熟效率、亮度和光稳定性。 在出芽酵母酿酒酵母和 E. 大肠杆菌中折叠的 YFP 中进行的研究表明，YFP 成熟和折叠效率对于计数蛋白质不是主要问题，特别是对于周转率低的蛋白质。
使用酵母是有利的，因为荧光融合蛋白可以使用同源重组替换天然蛋白，这使得能够确定融合蛋白的功能。 通过在 FP 和蛋白质样品之间使用灵活的连接体，可以改善某些蛋白质的功能。 由于内源基因不能用标记版本替换，因此需要使用其他蛋白质计数方法。 可以通过在免疫印迹后进行校正来量化肌动蛋白斑点中的局部肌动蛋白丰度。 但是，这种方法只有在假设标记和未标记的肌动蛋白以相似的效率用于肌动蛋白斑点的情况下才有可能。 Engel 等人在突变背景下使用逐步光漂白方法来计数绿藻莱茵衣藻鞭毛中外源标记蛋白中的外源标记蛋白。 由于内源基因不会定位，因此标记和未标记蛋白的比率假设不需要成立。 最近开发的“基因组编辑”技术使得能够在任何模型生物体中标记内源基因，其中“锌指核酸酶或转录激活因子样效应物核酸酶基因可以被引入。”
测量蛋白质数量的环境非常重要。早期研究采用体外标准，其中背景对荧光强度的影响未知。这意味着需要免疫印迹或内标来校准细胞内的荧光强度。最近的实验表明，体外 YFP/GFP 与细菌或酵母中的 YFP/GFP 相当。此外，如果 FP 被紧密地包装成结构，则会发生荧光淬灭。淬灭对计数蛋白质的影响应根据目标结构的具体情况进行单独检查。借助专用设备和分析的荧光寿命成像可用于测量由环境变化引起的淬灭。
细胞浓度应通过称为流式细胞术或荧光相关光谱的细胞分选设备进行验证，以获得更高的分辨率。同样重要的是要确保来自荧光显微镜的蛋白质浓度与定量免疫印迹一致。在任何蛋白质计数实验中，合适的荧光蛋白基因、合适的标准和环境变化或淬灭可能性控制将确保对数据的适当解释，然后可以通过补充实验进行确认。
超分辨率显微镜技术可以产生细胞内结构的高分辨率图像，从而精确地定位单个荧光分子。对于此类技术，最重要的是简化 FP 高密度图像的分析，并将由于闪烁或光漂白失败造成的错误降至最低。单分子技术现在更常用于观察平均群体行为中的随机事件。使用此类技术的好处是可以直接计数分子，无需使用集体图像，甚至可以确定位于衍射极限区域内的不同蛋白质复合物。超分辨率成像可以导致对更多蛋白质的量化。
计数细胞中的蛋白质分子对于确定结构模型和蛋白质功能至关重要。在体外，蛋白质数量有助于确定反应速率，并更多地了解多蛋白质。介绍的两种方法是逐步光漂白和与给定标准的比率比较。这可以在任何配备荧光显微镜的实验室中使用来分离特定蛋白质。当然，每种方法，包括这种方法，都有很多优点和缺点。FP 的特性对两种方法都非常重要。还有其他方法可以帮助验证蛋白质的数量，例如电子显微镜。荧光显微镜有助于确定蛋白质的精确数量及其结合范围。
来源: Coffman VC, Wu JQ. Trends Biochem Sci. 2012 年 9 月 1 日。