结构生物化学/DNA 扩增技术：聚合酶链式反应 (PCR)

历史

1984 年，Kary Mullis 发明了一种扩增 DNA 序列的方法。在以前的尝试中，DNA 聚合酶无法承受温度变化。然而，Mullis 在他的方法中使用了来自嗜热菌 (Thermus aquaticus) 的聚合酶，这种细菌生活在温泉中，这使得 PCR 可以在高温条件下进行。

概述

聚合酶链式反应 (PCR) 是一种非常有效的技术，可以获得特定 DNA 链的多个相同副本（扩增 DNA）。PCR 可用于扩增 DNA、突变 DNA、删除 DNA 和引入限制性内切酶位点。PCR 通过重复一个循环来进行，该循环由几个步骤组成。此过程在指定目标 DNA 区域或要扩增的 DNA 序列（目标序列）后执行。目标序列顾名思义，是特定部分的 DNA，需要进一步研究。简而言之，一个 PCR 循环包括以下步骤：

PCR 循环重复之前的准备
- 将 PCR 成分添加到含有待扩增 DNA 的溶液中
  - 此步骤仅在第一个 PCR 循环之前执行。建议在第一个循环之后不要添加成分，因为 PCR 反应对温度敏感（温度的微小变化会极大地影响反应）
  - 要添加的成分如下：
    - DNA 模板，在此过程中要进行扩增。
    - 一对引物（通常在 10-30 个核苷酸之间），与侧翼序列（目标序列直接左侧或右侧的几个碱基）互补。这两个不同的引物将被称为引物 F（正向引物）和引物 R（反向引物）。
    - 四个dNTP（脱氧核糖核苷酸三磷酸）；它们是：dATP、dGTP、dCTP 和 TTP
    - 氯化镁 (MgCl₂)，以稳定磷酸基团的电荷并激活复制过程。
    - 耐热 DNA 聚合酶；耐热性非常重要，因为 PCR 反应在不同的温度下进行。这种耐热 DNA 聚合酶是从一种嗜热细菌嗜热菌 (Thermus aquaticus)中获得的，这种细菌生活在温泉中。因此，这种 DNA 聚合酶被称为Taq DNA 聚合酶。根据 PCR 的目的和要求，可以使用具有不同特性的其他聚合酶；例如，某些聚合酶，如 Pfu Turbo，具有更高的保真度，但对它们的要求高得多。
    - 缓冲溶液以稳定 DNA 样本。
    - 为了最大限度地提高此过程的效率，可以使用混合液，其中包含引物、MgCl₂、缓冲液和 Taq 聚合酶。
  - 这些成分必须过量添加，以确保当两条 DNA 链在第二步中分离时，两条 DNA 重新杂交的可能性最小化。

PCR 循环（执行大约 20-30 个循环）
1. 链分离
  - 链分离是为了将目标序列和侧翼序列暴露给引物。此步骤是通过加热溶液来完成的，导致维持双螺旋结构的氢键断裂。
  - 参数
    - 温度：约 95^oC
    - 时间：15 到 30 秒（将 DNA 分离成 2 条单链）
2. 引物杂交（也称为退火步骤）
  - 在此步骤中，溶液冷却至约 54^oC。通过冷却溶液，允许引物通过氢键与侧翼序列杂交。
  - 两条主链重新杂交的可能性非常大，因为两条链彼此互补。幸运的是，如前所述，可以通过在溶液中加入过量的引物来轻松避免这种情况。预期过量的引物会在任何两条互补的 DNA 杂交之前与侧翼序列杂交。
3. DNA 合成（也称为延伸步骤）
  - 溶液加热至 72^oC。在这种最佳温度下，Taq 聚合酶将开始延伸两个引物。
  - 有两种引物；每种都是侧翼序列的互补寡核苷酸。
  - 延伸的过程与 DNA 的常规聚合类似。引物从 5' 端到 3' 端延伸（这与实际 DNA 链的方向相反；包含目标序列、侧翼序列和未扩增序列的链）。

- 注意:
  - 在第一个循环结束时，除了原始 DNA 链之外，我们还获得了两种新型链。这些链是每种引物的延伸。它们包含：
    - 一个引物（例如：引物 A）
    - 目标序列
    - 侧翼序列的互补序列（未与该链中包含的引物杂交的序列；例如：引物 B 侧翼序列的互补序列）
    - 此侧翼序列互补序列之后其余的非目标序列。
  - 在第二个循环中，一些引物将与第一个循环中获得的新型序列杂交（例如：在从引物 A 延伸的较短链上，引物 B 将附着到其侧翼序列并开始延伸循环，直到它到达较短链的末端，即引物 A 的侧翼序列）。
  - 在第二个循环中，形成的新型链，短链包含：
    - 一个引物（例如：引物 B）
    - 目标序列
    - 可以与引物 A 杂交的侧翼序列
  - 在第二个循环中，除了形成短链之外，还可以形成与第一个循环中形成的相同的链。
  - 从第二个到第 n 个循环，短链以指数级扩增，而稍长的链（第一个循环中形成的唯一链）以算术级扩增。
  - 此循环重复n次。在第n次重复时，将有 2ⁿ 个所需序列。

文件：PCR 步骤.jpg

具有详细步骤的 PCR 过程。可以重复多次循环以扩增原始 DNA 结构

最后，反应通常在完成后的 4 摄氏度下保持，以稳定对温度敏感的 DNA。

额外步骤

在最后一个 PCR 循环完成后，在 70-74°C 下进行最后一步延伸，持续至少 5 分钟。此步骤将保证任何剩余的 DNA 链完全延伸。此外，可以在 4°C 下无限期地进行保持步骤，以储存 DNA 产物。

热循环仪

文件：新型 PCR 机器.jpg

具有温度梯度的 PCR 机器

热循环仪可以通过不断冷却和加热试管来执行 PCR 过程的不同步骤。它们使用珀耳帖效应，该效应允许通过简单地反转电流来加热和冷却固定 PCR 管的块。薄壁反应管，无 RNAase 和 DNAase，适合 PCR。由于它们的厚度，它们可以创造热导率，以实现快速热平衡。如下一张图片所示，大多数现代热循环仪将具有加热的盖子，以防止反应管顶部的冷凝和每个管底部的蒸发。

结果解释

为了确保 PCR 扩增的质量，需要进行凝胶电泳。为了准备这一步，需要在事先完成一系列步骤：

1. 准备 1% 琼脂糖凝胶：称取 1 克纯化的琼脂糖，用 TAE（Tris-乙酸）缓冲液溶解至 100 毫升。（图 A）

2. 加热。将溶液在微波炉中加热，直到所有琼脂糖颗粒完全溶解。

3. 添加溴化乙锭。溶液冷却后，向溶液中加入 5 微升溴化乙锭。溴化乙锭将附着到 DNA 分子上，并在紫外光背景下使链脱颖而出（用作核酸染色剂）。

4. 琼脂糖聚合。在插入一个孔板以将样品加载到其中之后，等待琼脂糖完全聚合。此过程可能需要长达 30 分钟。

**图 B**：琼脂糖聚合。此过程可能需要长达 30 分钟。在此过程中，托盘不可移动

5. 添加缓冲溶液。用 TAE 溶液充满腔室，以在外部环境和 DNA 样本之间形成屏障。

6. 添加 DNA 样本。应将上样缓冲液添加到 DNA 样本中，并运行适当的 DNA 梯度，以确定样本中千碱基对的大致分子量。

7. 施加电流。DNA 必须位于靠近负极的位置，远离正极。

8. 使用紫外光可视化结果。

文件：UV 可视化.jpg

图 F：凝胶的紫外可视化

优点

PCR 是一种流行的 DNA 扩增方法，因为它具有多种优势。其中一些优势包括：

研究人员不需要阐明目标序列的序列。他们只需要知道侧翼序列的序列。
即使目标序列远大于引物，仍然可以合成。
制备的引物不必与侧翼序列完全匹配。
PCR 非常特异性。
PCR 非常敏感，能够扩增单个 DNA 分子。
得到的 DNA 可以进一步处理，例如突变、缺失或克隆过程。

机制

在这个例子中，使用以下约定：

BOLD = 侧翼序列及其互补序列
ITALICS = 目标序列及其互补序列
NORMAL = 剩余序列（DNA 链未扩增的部分）
BOLD/ITALICS= 引物

PCR 不同阶段形成的序列

原始 DNA 分子

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC CGCG...
...GCGC AAC GTCGATGACTGAG GGG GCGC...

分离和连接引物后（第一个循环开始）

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC CGCG...

AAC

CCC

...GCGC AAC GTCGATGACTGAG GGG GCGC...

第一次序列延伸后（第一个循环结束）

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC CGCG...

AAC GTCGATGACTGAG GGG GCGC...

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC
...GCGC AAC GTCGATGACTGAG GGG GCGC...

分离序列并连接另一个引物后（第二个循环开始；与第一个循环中形成的序列相同的序列形成未显示）

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC CGCG...

AAC GTCGATGACTGAG GGG GCGC...

CCC

AAC

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC

...GCGC AAC GTCGATGACTGAG CGG GCGC...

序列延伸后（形成短序列，第二个循环结束）

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC CGCG...

AAC GTCGATGACTGAG GGG GCGC...

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC

...GCGC AAC GTCGATGACTGAG CGG GCGC...

分离短序列并添加引物后（第三个及后续循环开始；仅显示短序列形成）

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC CGCG...

AAC GTCGATGACTGAG GGG GCGC...

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC

CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC

...GCGC AAC GTCGATGACTGAG CGG GCGC...

延伸短序列后（第三个及后续循环结束；仅显示短序列形成）

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC CGCG...

AAC GTCGATGACTGAG GGG GCGC...

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC

...GCGC AAC GTCGATGACTGAG CGG GCGC...

短序列将重新分离，以便新的引物可以在后续循环中连接。

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC

CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC

CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

引物将延伸形成额外的短序列。最后两点在后续循环中重复，直到合成足够的靶序列。

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

另一个 PCR 图表

媒体：PCR diagrams.pdf

PCR 的实际应用

聚合酶链反应已成为医学诊断的重要工具。PCR 可以检测和识别导致感染的细菌和病毒，如结核病、衣原体、病毒性脑膜炎、病毒性肝炎、HIV 等。一旦为特定生物体的 DNA 设计了引物，使用 PCR 检测患者血液或组织中病原体的存在或不存在就变得简单了。由于 PCR 可以轻松区分我们每个人拥有的微小 DNA 变异（使我们每个人在基因上独一无二），这种方法也导致了新型基因检测的出现。这些检测不仅诊断患有遗传疾病的人，还诊断携带可能遗传给后代的有害变异（突变）的人。这些携带者通常不受突变基因的影响，但他们可能会导致下一代出现疾病（例如，导致囊性纤维化的突变）。许多新型基因检测是人类基因组计划的结果，该计划是确定和研究所有人类基因的巨大国际努力。该项目正在快速朝着最终目标发展，即对典型人类细胞中的整个 DNA 进行测序。DNA 测序意味着确定构成任何 DNA 链的四种不同核苷酸的精确顺序。DNA 测序揭示了构成基因的核苷酸的关键变异。这些突变变化会导致疾病甚至死亡，迫使基因产生异常蛋白质，有时甚至根本不产生蛋白质。DNA 测序首先涉及分离和复制 DNA 片段以进行核苷酸分析。因此，PCR 是人类基因组计划必不可少的工具，因为它可以快速轻松地为这种研究生成无限量的任何 DNA 片段。PCR 是一种直接的方法，可以区分单个基因中混乱的不同突变，每个突变都可能导致疾病，如杜氏肌营养不良。它还有助于医生跟踪特定癌症特征的 DNA 异常的存在或不存在，以便他们尽快开始和停止药物治疗和放射治疗。PCR 有望极大地改善骨髓移植供体和受体的基因匹配。该技术无与伦比的能力，即使是对最微量甚至古老和受损的 DNA 进行识别和复制，已被证明在法律领域，特别是刑事诉讼领域非常有价值。PCR 是法医 DNA 测定的不可或缺的辅助手段——通常称为 DNA 指纹识别。在犯罪现场发现的 DNA 痕迹也可以使用 PCR 扩增，从而提供足够的 DNA 量与嫌疑人的 DNA 进行匹配。DNA 是一个极其稳定的分子，尤其是在受到空气、光线和水的保护时。在这种情况下，大量的 DNA 片段可以保存数千年或更长时间。因此，PCR 为扩增此类古代 DNA 分子提供了一种极佳的方法，以便可以对其进行分析。该技术还可用于扩增尚未分离和培养的微生物的 DNA。来自这些 PCR 产物的序列可以为生物体之间的进化关系提供相当大的见解。

PCR 的变体

由于 PCR 的高度适应性，许多基于原始 PCR 方法的新生化技术已经问世。一些常见的技术按字母顺序列出如下。

等位基因特异性 PCR 是一种基于单核苷酸多态性 (SNP) 的克隆技术。这需要一个等位基因之间存在差异的 DNA 序列，并使用 3' 端包含 SNP 的引物。

组装 PCR，更正式地说称为聚合酶循环组装 (PCA)，是一种通过将 PCR 应用于小的寡核苷酸并将它们杂交在一起合成长链 DNA 寡核苷酸的方法。整个过程包括两组 PCR 反应。第一个反应利用正向和反向引物将具有互补序列的寡核苷酸片段退火在一起。第二个反应使用另一组引物来进行常规 PCR 反应，这将扩增第一个反应的结果。只有较大的寡核苷酸链被扩增，从而将它们与其他不完整的较短片段区分开来。一旦整个反应完成，就可以进行凝胶电泳来分离和识别已完成的链。

不对称 PCR 是一种生物化学技术，它专注于扩增一条 DNA 链而不是另一条链。为此，执行正常的 PCR 反应，但使用与靶链反应的引物过量或不存在与互补链反应的引物。这种方法用于某些类型的法医测序和探测，其中只有一种 DNA 链是首选。

菌落 PCR 是一种在载体（如大肠杆菌菌落）中扩增 DNA 以识别靶 DNA 的生物化学技术。该过程的第一步涉及使用无菌牙签或移液器吸头从培养皿中取出载体样本。将样品转移到 PCR 主混合液或高压灭菌水中，在那里进行正常的 PCR 反应以确定菌落是否包含目标 DNA 片段或质粒。

数字 PCR 同时扩增数千个样品。

解旋酶依赖性扩增使用恒定温度，而不是循环通过变性、退火和延伸循环。DNA 解旋酶是一种酶，它解开 DNA 并用于代替热变性。

热启动PCR 是一种PCR形式，其重点是最大限度地提高产物产量。为了实现这一目标，使用化学修饰来限制聚合酶活性，直到反应开始。这种限制减少了非特异性聚合酶扩增。接下来，反应本身是在极高的温度下进行的，使用从嗜热生物体获得的聚合酶，例如来自海洋热液喷口的古细菌。这些升高的温度进一步防止非特异性聚合酶扩增，导致目标产物产量更高。

序列间特异性PCR 是一种用于DNA指纹识别的技术。它可以扩增特定区域，生成唯一的扩增片段指纹图谱。

反向PCR 是一种经过设计的方法，用于绕过常规PCR的限制，常规PCR需要事先知道目标序列周围的侧翼序列。反向PCR的命名恰如其分，因为它可以用于确定目标链的侧翼序列。但是，该方法也有自己的局限性：必须已知一个内部序列才能执行它。

连接介导PCR 是一种用于DNA测序、基因组行走、DNA足迹分析的技术。该技术利用连接到所需DNA上的小DNA接头和多个与接头退火的引物。

甲基化特异性PCR (MSP) 检测基因组DNA中CpG岛的甲基化。DNA经亚硫酸氢钠处理，并被PCR引物识别。使用两种PCR来修饰DNA。一种引物识别具有胞嘧啶的DNA以扩增甲基化DNA，另一种引物识别具有尿嘧啶/胸腺嘧啶的DNA以扩增未甲基化DNA。

迷你引物PCR 允许PCR靶向更小的引物（小寡核苷酸）（由9-10个核苷酸组成）结合区域，并用于扩增保守的DNA序列。

多重PCR 是一种生化技术，其重点是通过在单个PCR反应中添加多个引物来同时扩增多个目标DNA产物。多重PCR是DNA检测的首选方法，因为它允许分析样本中的缺失、突变和多态性。

多重连接依赖探针扩增 (MLPA) 使用一对引物扩增多个靶标。

巢式PCR 是一种PCR形式，可最大限度地提高目标DNA片段扩增的准确性。巢式PCR包含两个独立的反应。第一个是正常的PCR反应，其中使用一对引物来扩增目标片段。第二个反应添加了第二对称为“巢式引物”的引物，它们与第一个反应的产物结合并扩增它们。通过执行两组PCR反应，该方法最大限度地提高了准确性，因为两对引物都与错误的目标片段结合的可能性非常低。

重叠延伸PCR 允许构建具有插入的DNA序列，该序列插入超出引物长度限制的范围。

PAN-AC 使用等温条件进行扩增。

定量PCR (Q-PCR) 测量PCR产物的数量。它测量DNA、cDNA和RNA的起始量。它通常用于确定DNA序列是否存在以及它在样本中的拷贝数。该技术使用荧光染料（例如TaqMan）来测量扩增产物的量。

逆转录PCR (RT-PCR) 是一种经过设计利用我们对逆转录如何从RNA形成互补DNA的知识的生化技术。RT-PCR分两步进行。第一步，使用寡聚dT将目标RNA链逆转录成其互补DNA，寡聚dT替代了引物的作用。在第二步中，通过添加与DNA特异的引物来进行常规PCR反应，以帮助扩增目标序列。RT-PCR是一种高度灵敏的技术，它利用了RNA链（与它们的DNA对应物相比）的较小尺寸。RT-PCR是一种高度适用的技术。除了上述材料之外，该技术还可用于通过合成互补DNA来大量生产目标RNA，互补DNA随后可以通过载体进行克隆。

降落PCR 是一种PCR技术，其重点是最大限度地提高目标产物产量。因此，它可以被视为热启动PCR方法的替代方法。为了实现其目标，该方法在高温退火温度下进行PCR反应，这减少了非特异性聚合酶扩增。换句话说，只有包含目标序列的片段才会被引物扩增。随着片段被反复扩增，温度逐渐降低，直到确定只有目标片段保留下来。

通用快速行走 用于基因组行走和遗传指纹识别。这是一种比普通单侧PCR方法更特异的两侧PCR。

串联重复序列变异数 (VNTR) PCR 靶向基因组中表现出长度变异的区域。基因型的分析包括通过凝胶电泳对扩增产物进行大小排序。分析较小的VNTR片段（短串联重复序列，STR）是DNA指纹识别的基础。

DNA聚合酶

Klenow片段 最初是从大肠杆菌的DNA聚合酶I（第一种用于PCR的酶）中获得的。由于该聚合酶在高温下不稳定，因此需要在每个循环中补充。它在PCR中不常用。

噬菌体T4 DNA聚合酶 最初用于PCR，但也会被热破坏，并且具有比Klenow片段更高的保真度复制。

热水栖热菌 (Taq) 是常用的，并且是第一个用于PCR的耐热（耐热）聚合酶。这种酶从天然来源或从在大肠杆菌中表达的克隆基因中分离出来。

Stoffel片段 由Taq聚合酶的截短基因制成，并在E. coli中表达。这种酶缺乏5'-3'外切核酸酶活性，并且能够扩增比其天然酶更长的靶标。

Faststart聚合酶 是Taq聚合酶的一种变体，需要强烈的热活化。由于其低温聚合酶活性，应避免非特异性扩增。

Pfu DNA聚合酶 从古细菌火球菌中分离出来。这具有校对活性。由于错误随着PCR的进行而增加，因此在将产物单独克隆用于测序或表达时，Pfu是首选。

Vent聚合酶 极耐热，从热球菌中分离出来。

Tth聚合酶 是一种来自嗜热栖热菌的耐热聚合酶。这种聚合酶在存在Mn2+离子的情况下具有逆转录酶活性，允许从RNA靶标进行PCR扩增。

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