结构生物化学/酶催化机制/BamHI
BamHI( from BAcillus amyloli) 是一种 II 型限制性内切酶，源自枯草芽孢杆菌，具有识别短序列 DNA 并特异性地将其在靶位点切割的能力。为了了解这些限制性内切酶如何与其特定序列结合，BamHI 成为一个受欢迎的研究目标。通过结晶 BamHI 内切酶，科学家了解了 DNA 结合蛋白如何从细胞中各种非特异性序列中选择其特定靶标。
为了使限制性内切酶与它们的靶序列结合，它们必须首先与非特异性 DNA 结合。据信这些非特异性内切酶-DNA 复合物在其内切酶-DNA 接口处更具水合性，通过静电相互作用稳定，并且在结合过程中导致低热容变化。在没有与非特异性序列发生强相互作用或结合的情况下，这些弱相互作用有助于这些内切酶的滑动能力。这些内切酶不是稳定地与某个序列结合，而是沿着序列滑动，直到找到特定的序列匹配。以下是对两位科学家Hector Viadiu 和Aneel K. Aggarwal 在 2000 年进行的一项研究的总结。
本研究的目的是确定 BamHI 如何与其非特异性 DNA 序列结合并与其靶序列相互作用。BamHI 倾向于在特定的切割位点与以下序列结合，如下所示，其中直线表示切割位点。
作为一种限制性内切酶，特定序列的改变，即使是像一个碱基对一样小的改变，也足以使序列变得非特异性。实验首先从溶液中结晶具有 DNA 序列 5'-ATGAATCCATA-3' 的非特异性晶体。在该序列中，GAATCC 与 BamHI 的靶切割类似。研究揭示了 BamHI 在这种类似序列存在下的结构。
BamHI 是一种涉及三种不同状态的催化机制。第一种状态，即反应发生之前，称为预反应状态。接下来是中间状态，称为过渡状态。最后一种状态是反应后状态。以下是该机制发生步骤的摘要：存在一个水分子和一个谷氨酸。这使得谷氨酸能够夺取水的质子并提取质子。这会留下一个羟基，该羟基将对磷酸原子进行亲核攻击。由于存在两种金属，负电荷会被稳定。然后，将会有一个五价磷酸盐，并且额外的负电荷会被金属离子稳定。磷酸盐将有一个额外的氧原子，导致溶液中的水表现为供体。这允许磷酸盐恢复其配位的趋势。最后，氧原子将攻击水分子，质子将转移到离去基团，导致反应后状态。总体而言，在比较预反应状态和反应后状态时，观察到磷酸盐的轻微移动。
尽管 DNA 序列相似，但 BamHI 在特异性复合物中的行为完全不同。不仅 BamHI 二聚体的底部松散，而且酶也相对于其轴线倾斜了 20 度。因此，碱基对的替换不仅会影响该特定碱基对的相互作用，还会影响整个序列和 BamHI 内切酶的构象。构象的变化在图 1 中有所体现。在特异性复合物中，一个单体 C 末端的α螺旋展开以与另一个单体相互作用。然而，当目标序列被改变时，复合物变得非特异性。在非特异性复合物中，这些单体不会展开并相互作用。由于没有构象变化，来自 BamHI 序列的氨基酸远离 DNA 并且不参与任何结合。因此，切割不会发生。
BamHI 通过两种方式裂解 DNA。首先，BamHI 通过与二价阳离子共结晶来裂解 DNA。例如，BamHI 将与两个二价金属结合。其次，BamHI 通过直接与 DNA 本身结合来裂解 DNA。在活性位点，酶的电荷为负。金属位于活性位点和 DNA 之间。该反应的抑制剂包括钙。BamHI 通过向第二个水分子捐赠一个质子来裂解磷酸二酯键。存在一个预反应位点和一个反应后位点，指示哪些序列已被裂解。磷酸盐位于 5' 方向，而氧原子位于 3' 方向。
只有当 BamHI 检测到特定 DNA 序列时，才会触发 BamHI 的构象变化。否则，BamHI 的活性位点残基朝外，不会与非特异性序列相互作用或结合。BamHI 内切酶的这种特异性至关重要，因为它可以避免在类似 DNA 序列处发生致命的裂解。
每次细菌复制 DNA 时，都会对其进行甲基化。BamHI 等限制性内切酶无法裂解被甲基化的 DNA 序列。然而，来自病毒的 DNA 不会被甲基化，因此它们最终会被 BamHI 裂解。如果细菌想要存活，它们必须能够识别哪些序列是被甲基化的。当酶识别到正确的位点时，DNA 就会靠近。当 DNA 改变构象时，它会远离活性位点，因此不会进行催化。许多残基负责催化，并且许多残基靠近活性位点，以便识别特定的底物并确保它们是正确的底物。
BamHI 能够从数百万个可能的序列池中识别出特定 DNA 序列，方法是简单地与任何 DNA 结合。然后，它们沿着 DNA 链滑动以找到正确的序列。当它找到特定的序列时，它将改变构象并包围 DNA。
1. Viadiu H, Kucera R, Schildkraut I, Aggarwal AK, "限制性内切酶 BamHI 与非特异性 DNA 的结晶。" J Struct Biol 1(81-5):, 2000。
2. Viadiu, Hector. 催化机制示例。生物化学讲座。2012 年 12 月 3 日