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结构生物化学/真核重组

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细菌和病毒基因并非唯一可以引入宿主细胞的序列。真核基因可以被引入细菌以产生所需的蛋白质产物。也有可能将 DNA 引入高等生物,这已导致基因治疗。虽然真核基因的操作具有许多可能性和优势,但它也是争议的来源。

克隆真核 DNA

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大多数真核 DNA 中间插入了内含子和外显子,它们会打断基因,无法被细菌表达。克服这种障碍的方法是利用与 mRNA 互补的 DNA(mRNA 剪接内含子)。形成互补 DNA 的关键是逆转录,它合成与 RNA 模板互补的 DNA 链。可以制作包含细胞中所有 mRNA 的互补 DNA,将其插入载体,然后将其插入细菌(这种集合称为 cDNA 文库)。

互补 DNA 分子可以插入有利于它们在宿主中高效表达的载体中,称为表达载体。为了最大限度地提高转录,cDNA 被插入载体中启动子的附近。克隆可以根据它们在细菌中指导合成外源蛋白质的能力进行筛选。

高等生物中的重组 DNA

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细菌缺乏进行翻译后修饰的必要酶。因此,许多真核基因只能在真核宿主细胞中正确表达。重组 DNA 分子可以通过多种方式被引入动物细胞。首先,被磷酸钙沉淀的外源 DNA 分子被动物细胞吸收。另一种方法涉及将 DNA 微量注射到细胞中。第三种方法利用病毒,特别是逆转录病毒,因为它们通常不会杀死宿主,并且会随机整合到宿主染色体 DNA 中,以将新基因引入动物细胞。

莫洛尼鼠白血病病毒接受长达 6 千碱基对的插入片段,并且由该载体引入的一些基因可以高效表达。牛痘病毒是一种大型含有 DNA 的病毒,在哺乳动物细胞的细胞质中复制,在那里它会关闭宿主细胞的蛋白质合成。杆状病毒感染昆虫细胞,这些细胞可以很容易地培养。

植物细胞改造

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文件:电穿孔.jpg
电穿孔

什么是电穿孔?它是通过帮助极性分子插入宿主细胞的细胞膜,将外源 DNA 引入植物细胞的方法。该过程是引发强电场,使质膜对极性分子具有渗透性,从而使这些分子能够通过细胞。

第一步:通过添加纤维素酶去除纤维素壁,生成原生质体。

第二步:应用电脉冲来扰乱疏水膜,使其对质粒 DNA 具有渗透性,使其能够进入。

第三步:然后允许细胞壁重新形成。


电穿孔:肿瘤诱导质粒 (Ti 质粒) 携带指示细胞转变为肿瘤状态的指令。Ti 质粒可以通过将自身整合到受感染植物细胞的基因组中 (T-DNA) 来将外源基因传递到一些植物细胞中。外源 DNA 可以通过电穿孔被引入植物细胞。去除纤维素壁,生成原生质体。然后将电脉冲施加到原生质体和质粒 DNA 的悬浮液中。强电场使膜对大分子暂时具有渗透性,质粒 DNA 分子进入细胞。当细胞壁重新形成时,植物细胞变得可行。

基因枪:将微弹射向目标细胞是最有效的植物细胞转化方法。

转基因生物创造了具有有益特征的植物,例如能够在贫瘠的土壤中生长、对气候变化的抵抗力、对害虫的抵抗力以及营养强化。然而,由于未知的副作用,它们的使用存在很大争议。

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