结构生物化学/真核重组
细菌和病毒基因并非唯一可以引入宿主细胞的序列。真核基因可以被引入细菌以产生所需的蛋白质产物。也有可能将 DNA 引入高等生物,这已导致基因治疗。虽然真核基因的操作具有许多可能性和优势,但它也是争议的来源。
大多数真核 DNA 中间插入了内含子和外显子,它们会打断基因,无法被细菌表达。克服这种障碍的方法是利用与 mRNA 互补的 DNA(mRNA 剪接内含子)。形成互补 DNA 的关键是逆转录,它合成与 RNA 模板互补的 DNA 链。可以制作包含细胞中所有 mRNA 的互补 DNA,将其插入载体,然后将其插入细菌(这种集合称为 cDNA 文库)。
互补 DNA 分子可以插入有利于它们在宿主中高效表达的载体中,称为表达载体。为了最大限度地提高转录,cDNA 被插入载体中启动子的附近。克隆可以根据它们在细菌中指导合成外源蛋白质的能力进行筛选。
细菌缺乏进行翻译后修饰的必要酶。因此,许多真核基因只能在真核宿主细胞中正确表达。重组 DNA 分子可以通过多种方式被引入动物细胞。首先,被磷酸钙沉淀的外源 DNA 分子被动物细胞吸收。另一种方法涉及将 DNA 微量注射到细胞中。第三种方法利用病毒,特别是逆转录病毒,因为它们通常不会杀死宿主,并且会随机整合到宿主染色体 DNA 中,以将新基因引入动物细胞。
莫洛尼鼠白血病病毒接受长达 6 千碱基对的插入片段,并且由该载体引入的一些基因可以高效表达。牛痘病毒是一种大型含有 DNA 的病毒,在哺乳动物细胞的细胞质中复制,在那里它会关闭宿主细胞的蛋白质合成。杆状病毒感染昆虫细胞,这些细胞可以很容易地培养。
什么是电穿孔?它是通过帮助极性分子插入宿主细胞的细胞膜,将外源 DNA 引入植物细胞的方法。该过程是引发强电场,使质膜对极性分子具有渗透性,从而使这些分子能够通过细胞。
第一步:通过添加纤维素酶去除纤维素壁,生成原生质体。
第二步:应用电脉冲来扰乱疏水膜,使其对质粒 DNA 具有渗透性,使其能够进入。
第三步:然后允许细胞壁重新形成。
电穿孔:肿瘤诱导质粒 (Ti 质粒) 携带指示细胞转变为肿瘤状态的指令。Ti 质粒可以通过将自身整合到受感染植物细胞的基因组中 (T-DNA) 来将外源基因传递到一些植物细胞中。外源 DNA 可以通过电穿孔被引入植物细胞。去除纤维素壁,生成原生质体。然后将电脉冲施加到原生质体和质粒 DNA 的悬浮液中。强电场使膜对大分子暂时具有渗透性,质粒 DNA 分子进入细胞。当细胞壁重新形成时,植物细胞变得可行。
基因枪:将微弹射向目标细胞是最有效的植物细胞转化方法。
转基因生物创造了具有有益特征的植物,例如能够在贫瘠的土壤中生长、对气候变化的抵抗力、对害虫的抵抗力以及营养强化。然而,由于未知的副作用,它们的使用存在很大争议。