结构生物化学/荧光蛋白
荧光是光（例如可见光）被分子吸收并在更长波长处重新发射以产生独特颜色的过程。这是一种基于原子或分子中电子激发的物理现象；发射在更长的波长处。荧光使我们能够看到事物在细胞中的相互作用方式，以及它们的位置和所走的路径。
荧光蛋白最初是从水母Aequorea Victoria中提取出来的。它们对细胞生物学的研究至关重要。荧光蛋白包含各种颜色变体，它们在不同的波长处发出不同的颜色，因此充当有价值的探针，可用于活细胞成像。这些蛋白质可以用作体内标记物，用于全身成像和癌症检测，以及在蛋白质融合可以用来监测细胞内动力学和转录方面的细胞器中。有助于蛋白质荧光特性的重要方面是它的结构，它由不同的氨基酸组成，具体取决于蛋白质和局部微环境。已经创建了各种荧光蛋白衍生物，用于各种标记，其中最广泛使用的是绿色荧光蛋白，罗杰·齐恩（来自加州大学圣地亚哥分校的科学家）因其研究而获得了诺贝尔和平奖。
了解蛋白质结构可以让人进一步了解蛋白质的功能。对于荧光蛋白的结构来说，情况就是这样。对于绿色荧光蛋白，它是由一个β桶结构组成，该结构由一个β螺旋和α螺旋组成，它们包围着生色团。生色团是分子中负责其颜色的部分。螺旋的生色团由三个氨基酸形成，它们形成一个三肽Ser65-Tyr66-Gly67。氨基酸残基的环化是形成咪唑烷酮环的原因。但是，三肽的一个重要特性是，氨基酸序列不是导致荧光的内在特性，因为在其他没有荧光的蛋白质中也发现了相同的氨基酸序列。咪唑烷酮环的进一步氧化会导致环与Tyr-66偶联，在荧光方面促成蛋白质的成熟。生色团的一个关键组成部分也是它处于两种状态。生色团的一种状态是质子化状态或占主导地位的状态，其激发最大值是395纳米。生色团的另一种状态是未质子化状态，其激发最大值是475纳米。由于绿色荧光蛋白的生色团的复杂性，该分子可以容纳修饰。一个重要的特征是，β桶中氨基酸残基的紧密堆积是稳定的，导致高荧光量子产率。由氢键贡献的紧密蛋白质结构也对pH值、温度和变性剂（如尿素）具有抵抗力。
黄色荧光蛋白
这些荧光蛋白以生色团中一个氨基酸残基的突变为代表。发现绿色荧光蛋白（GFP）中发现的酪氨酸发生了突变，导致偶极矩的稳定以及激发/发射光谱波长的变化，从而导致黄色荧光。此外，发现黄色荧光蛋白在生色团附近有一个新的苏氨酸残基 203。黄色荧光蛋白的进一步修饰可以增强蛋白质的亮度，这使其成为增强型黄色荧光蛋白 (EYFP) 的重要工具。这些蛋白质源自水母Aequorea Victoria，并经过修饰以创建与原始绿色荧光蛋白不同的荧光发射。
黄色荧光蛋白TagYFP是一种明亮的黄色荧光，推荐用于蛋白质定位和相互作用研究中的蛋白质标记。它也可能用于细胞和细胞器标记以及追踪启动子活性，尽管更喜欢 TurboYFP 和 Phl-Yellow 蛋白。它是一种单体蛋白，已成功用于融合，并且是在水母Aequorea macrodactyla中发现的类似 GFP 的蛋白质的基础上开发的。TagYFP 具有快速成熟阶段以及高 pH 稳定性和光稳定性。它的高 pH 稳定性使其比 EYFP 更稳定，而它的快速成熟使其能够产生更亮的荧光信号。TagYFP 也已被证明可以产生稳定的转染细胞系。
蓝色和青色荧光蛋白
蓝色和青色荧光蛋白是由位于生色团中的 Tyr 66 残基的修饰产生的。将 Tyr 转换为组氨酸会导致在 450 纳米波长处发出蓝色荧光。另一种修饰是将 Tyr 转换为色胺，导致在约 480-500 纳米波长处产生不同的荧光。此外，使用这些荧光蛋白的遗传标记表达为 TagBFP。这种蛋白质的一个优势是它易于表达和检测，可以在多种生物体中检测到。用 TagBFP 表达载体瞬时转染的哺乳动物细胞在转染后 10-12 小时内会发出明亮的荧光信号。没有观察到细胞毒性作用和可见的蛋白质聚集。TagBFP 在融合中的性能已在 β-肌动蛋白和 α-微管蛋白模型中得到证明。它可以用于与绿色、黄色、红色和远红色荧光染料的多色标记应用。然而，这些修饰的一个问题是，它们需要二次突变来增加折叠效率和亮度。幸运的是，基因组修饰不会危及生命。
红色荧光蛋白
已衍生出各种红色荧光蛋白衍生物，希望找到一种蛋白质，其荧光能力超过或等于 GFP（绿色荧光蛋白）。一种蛋白质衍生物来自珊瑚Dicosoma striata，也称为 DSRED。当它成熟时，发现该蛋白质的发射光谱约为 583 纳米。DSRED 的进一步修饰导致形成 DSRED2，该修饰在肽末端具有突变，可以防止蛋白质聚集的形成并降低毒性水平。此外，发现 DSRED2 也与 GFP 更兼容。这些蛋白质也以其四聚体结构为代表。
'绿色荧光蛋白' 绿色荧光蛋白 (GFP) 由大约 200 多个氨基酸残基组成。这种蛋白质在蓝光照射下会发出绿色荧光。GFP 主要从海洋生物体中分离出来：维多利亚多管水母。这种 GFP 有三个主要的激发峰值。一个强烈的峰值在 395 纳米波长，另一个较小的峰值在 475 纳米，而发射峰值在 509 纳米，这赋予了该蛋白质鲜明的亮绿色。另一种来自海羽的生物体在 498 纳米附近有另一个激发峰值。GFP 基因对于生物传感和报告基因表达的位置至关重要。它可以通过育种、体外注射或转化过程转入其他生物体的基因组。GFP 基因被引入各种细菌、酵母、真菌和其他多细胞生物体中。GFP 成为研究工具的故事始于 1992 年，当时哥伦比亚大学的马丁·查尔菲证明，制造 GFP 的基因在从水母基因组中移除并转移到其他生物体的细胞中时产生了荧光蛋白。查尔菲，一位发育生物学家，首先将该基因放入细菌和线虫中，创造了这些动物的“发光”版本。马丁·查尔菲、下村修和钱永健因其发现和开发绿色荧光蛋白于 2008 年 10 月 10 日获得了 2008 年诺贝尔化学奖。从那时起，研究人员已将 GFP 基因转移到许多其他生物体中，甚至包括在实验室培养皿中生长的人类细胞中。GFP 在天然色素中独一无二，因为它能够通过大气条件自动催化自身的生色团。通过这种方式，单一蛋白质既充当底物又充当酶。其他天然色素的产生需要多种酶。生物技术利用了 GFP 的这种独特特性，将其用作基因表达和蛋白质定位的体内标记。单体荧光蛋白变体
荧光蛋白最初在其自然状态下以二聚体、四聚体和寡聚体的形式存在。此外，荧光蛋白在细胞区室中形成二聚体的理论可能性，这是由于可能的高蛋白质浓度促成了二聚体化。因此，一直都在寻求使用单体荧光蛋白变体。然而，一个问题是，前几个单体荧光蛋白的荧光能力降低了。此外，单体的产生需要对结构进行大约 30 个氨基酸变化。但是，这些蛋白质的开发正在改进，这些蛋白质的量子产率和光稳定性都得到了提高。
荧光标签用于标记蛋白质、DNA 和抗体等分子。荧光标记利用荧光团与目标分子上的官能团反应。通过这种类型的分子标记产生探针。蛋白质印迹分析识别和分离蛋白质，因此这些荧光标签至关重要。尺寸排阻色谱法去除目标分子上的荧光团。荧光染料可用于指定细胞中存在的哪个细胞器，以便区分其独特的结构并进一步探索其各自的功能。这些标签和染料在显微镜和反向光漂白中很重要，因为它们对活细胞的危害小于量子点。荧光染料具有疏水性，因此在使用染料分离分子时使用特定的染料柱。
示例：蛋白质印迹分析
蛋白质印迹的目的是根据蛋白质结合特定抗体的能力来定位和确定蛋白质。蛋白质印迹分析可以检测混合物中众多蛋白质中感兴趣的蛋白质。完成蛋白质印迹后，从该过程中获得的信息是蛋白质的大小和蛋白质的表达量。蛋白质印迹分析可以对任何蛋白质样品进行，从细胞到组织，再到体外合成的重组蛋白。蛋白质印迹依赖的条件是用于探测目标蛋白质的抗体的质量。蛋白质印迹中使用的抗体必须对感兴趣的蛋白质具有特异性。
示例：绿色荧光蛋白 (GFP) 在暴露于蓝光时会变成绿色。 关于 GFP 的信息
X 射线荧光显微镜
硬 X 射线荧光显微镜可用于研究完整未染色生物组织中的微量金属分布。
微量金属元素是许多生命形式不可或缺的元素。金属有助于催化功能，有时甚至在细胞内发挥结构作用。例如，锌指结构域，其中锌离子有助于结合核酸和蛋白质。金属以其对人类健康和疾病的重大影响而闻名。因此，对这些微量元素的研究可以提供关于金属蛋白功能和途径的重要信息和推理。这些研究甚至可以找到定量研究这些微量元素的细胞内分布的治疗方法。
这些 X 射线荧光已被用于创建断层扫描图像，以可视化 10 微米细胞的结构。尽管使用这些高穿透 X 射线进行断层扫描非常有用，但也有一些限制会影响实验持续时间和图像的准确性。由于 X 射线荧光显微镜的这些局限性，一直都在进行研究以开发更好的 X 射线分辨率、探测器速度、低温环境以及辅助信号的追求。因此，未来将在 X 射线荧光断层扫描中出现许多有益的新方法。
硬 X 射线荧光，也称为 XRF，显微镜是追踪各种生物系统中微量金属分布的有用工具。对于铜、锌和其他相关微量元素等过渡金属，XRF 在 150 纳米的空间分辨率下提供了阿托克级灵敏度。如今，已能够同时绘制 10-15 种元素的图谱。元素的同时映射导致精确的元素共定位图。
硬 X 射线荧光的应用进一步改进了结构可视化，但出现了一些技术挑战，导致二维和低分辨率的实现。目前的进展使科学家能够克服一些最主要的限制，现在科学界能够创建亚 500 纳米分辨率的 XRF 断层扫描。具有这种分辨率的断层扫描可以在元素特异性领域提供极端的细节。这些 XRF 断层扫描的最新进展肯定会很快被利用。正在进行的其他开发包括低温显微探针，它们能够适应冷冻水合标本。
X 射线荧光过程非常适合量化微量元素。XRF 独特之处在于它不依赖于人工染料或荧光团来确定蛋白质的结构，而是通过将分子暴露于粒子（电子和质子）或 X 射线束，可以激发 X 射线荧光。使用 X 射线激发，轫致辐射背景变得不必要，从而使 WRF 显微镜能够显示出高空间分辨率。由于 X 射线穿透使科学家能够获得数十微米的样品厚度，因此 XRF 显微镜是形成生物样品断层扫描可视化的理想方法。
由于 XRF 断层扫描中涉及的许多技术挑战和分析复杂性，该方法尚未得到普遍应用。尽管如此，最近的进展已将 3D 分辨率提高到几个 100 纳米，适用于尺寸高达 10 微米的标本。这意味着可以使用高空间分辨率可视化多个元素的 3D 元素图谱。XRF 及其最新进展拥有光明的未来。结合生物、环境、材料和地质界的需求，XRF 看起来非常有前景。
XRF 断层扫描
术语“断层扫描”源于希腊语，意思是“切片成像”，这意味着它是一种从标本内部单一切片获取数据的技术。从倾斜角度对标本切片进行 3D 重建。考虑到连续切片是断层扫描的直接方法，重建任务可能非常繁重且耗时。这种直接方法，即实际进行物理切片，会导致明显的伪影，这被定义为整体上被视为人工对象的物体。作为对物理切片的一种替代方法，可以使用非破坏性技术，因为它们减少了标本制备要求，并且执行起来也容易得多、简单得多。与其他断层扫描方法相比，只有 XRF 显微断层扫描能够以与生物学直接相关的程度绘制微量元素分布图。
全场断层扫描
最近，X 射线荧光断层扫描已通过使用全场成像和结构化探测器方法得到证明。然而，这些新颖的全场成像和结构化探测器方法也有其优缺点。这些新兴技术的空间分辨率在 2 到 200 微米之间，灵敏度水平在 100ppm 到百分比水平之间。它们还具有广泛的元素对比度范围，使其不适合常规用于研究生物标本的细胞。
投影断层扫描
投影断层扫描是一种使用标本投影作为其输入数据的断层扫描重建算法的技术。有一个能量色散探测器，它对沿柱产生的任何信号敏感。在一定位置范围内测量 2D 数据，在多个角度进行测量，并且使用分析方法帮助构建标本的 3D 地图。使 X 射线荧光显微照片区别于其他断层扫描方法的是其自吸收效应。这包括标本对荧光的重新吸收和入射光束的吸收。当使用低荧光能量进行 X 射线显微照片时，对于厚标本，自吸收效应会增加。
自吸收对 XRF 断层扫描有重大影响。为了解决这个问题，需要良好的校正算法以确保图像清晰度，它们还会扩展标本尺寸域，以降低荧光能量并保持数据准确性。吸收图可用于估计不同荧光能量下的自吸收。使用能量色散探测器，记录了非弹性和弹性信号。这些非弹性和弹性信号提供了访问通常难以获得的主要轻元素分布的途径。
共聚焦断层扫描
共聚焦断层扫描被称为 XRF 断层扫描的直接空间方法，当轴向分辨率低于 5 微米时。在这种方法中，信号仅来自照明柱的一小部分，因为准直器限制了能量色散方向的视野。
共聚焦断层扫描只能直接访问标本的一小部分区域。不幸的是，这可能会使它难以针对标本中感兴趣的特征。研究人员提出了另一种解决此问题的方法：使用投影断层扫描进行低分辨率概述，然后进行感兴趣区域的共聚焦研究。
结构生物学最大的目标之一是了解细胞如何运作，以及它们如何感知和处理外部和内部信号。 遗传编码的荧光蛋白 (FP) 和荧光传感器可以帮助研究人员可视化细胞过程是如何运作的。 细胞是所有生命系统的基本组成部分，依赖于复杂的内部过程。 这些过程在微米尺度上在不同的膜隔室和细胞骨架位置发生。 荧光成像使用来自水母维多利亚水母及其近缘种的绿色荧光蛋白 (GFP) 可以帮助科学家进一步探索这些细胞过程。 GFP 由于其荧光，或其产生与照射光不同颜色的光的容量，可以作为重要的分子成像工具。 GFP 和荧光可以随着时间的推移监测细胞过程。 此外，GFP 由单个可移植的 DNA 序列编码，该序列可以很容易地与感兴趣的蛋白质融合并在活细胞内表达。 在 GFP 之前，研究人员依靠荧光抗体技术来检查蛋白质和核苷酸序列，但这只能在死亡的、固定的细胞或组织切片上进行。
随着 GFP 越来越受欢迎的分子成像工具，GFP 的改进和进步也随之出现。 GFP 的诱变导致其亮度和折叠效率增加，以及其寡聚化减少。 诱变也产生了可光活化或可光转换的 GFP 形式。 发现 GFP 只是更大的同源荧光蛋白家族中的一员，主要来自海洋珊瑚，由于结构和环境的变化，它们具有不同的颜色。 对这些物种中 FP 的定向诱变产生了 FP 调色板，涵盖了整个可见光谱范围。 多种颜色允许对细胞内多组蛋白质进行同时成像。
GFP 的发展最终催生了不同的成像技术，例如光漂白后荧光恢复、荧光相关光谱、FRET、荧光交叉相关光谱、全内反射显微镜、荧光寿命成像和光活化定位显微镜 (PALM)。 这些成像技术允许对细胞功能进行体内分析。
例如，FP 报告基因可用于监测标记的信号分子的行为及其组织，以及检测信号通路中每个组分的特定池。 这可以通过光漂白来完成，其中使用高强度激光脉冲光漂白细胞的某个区域，并通过延时显微镜记录未漂白分子从相邻区域移动到漂白区域的过程。 当用遗传编码的 FP 标记时，细胞内蛋白质的动力学特性，例如其在隔室之间的运动，也可以看到。 在光漂白和光活化中，FP 融合蛋白的整体功能可以在不干扰其他途径或细胞功能的情况下确定。
FP 在荧光成像方法中的使用也使蛋白质-蛋白质相互作用能够得到解决。 这可以通过 FRET 测量来完成，FRET 测量允许实时绘制细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的图谱。 在 FRET 中，一个报告基因是供体荧光团，另一个报告基因是波长更长的受体荧光团。 读出是能量从供体到受体的转移。 通过结合 GFP 变体，这些报告基因可以附着在不同的蛋白质上以测试它们的相互作用。
进一步开发的过程包括使用探针来监测 GTP 水解和细胞周期事件。 一种策略是使用可以诱导形成二聚体的小分子。 探针可用于在细胞的特定时间和地点驱动特定的生物活性。 另一种策略涉及光诱导开关，它利用光来激活信号分子。 探针还可以与锌和一氧化氮指示剂发生反应，这些指示剂是驱动生理过程或引发病理的无机物质。
报告基因技术允许对活体系统中的生化过程进行实时可视化，并提供了一种获得对细胞内信号网络的空间组织和调节的见解，这些网络是生物过程的基础。
已经开发了分子成像方法来分析磷酸化在活细胞中的作用。 这些方法涉及使用最近引入的荧光报告基因，这些报告基因可以对细胞中的磷酸化进行高分辨率成像。 这种分子成像为我们提供了对信号网络的时间和细胞定位的理解和见解。 在这些荧光成像技术发展之前，激酶作用的测量通常通过分析酶活性的事后 (意味着追溯) 来完成，通过免疫沉淀或免疫细胞化学技术。 延迟的测量并不像以前那样有效，因为它们存在特异性问题，并且无法实时报告激酶作用。 此外，在激酶作用后获取信息会导致丢失仅在活细胞中发现的关键信息。 因此，已经开发了荧光报告基因，用于在复杂混合物或活细胞中进行实时分析。
肽生物传感器通常用于测量体外磷酸化事件，具有良好的分辨率，并具有活细胞成像的潜力。 这些生物传感器遵循合成荧光团进入肽或蛋白质的基本设计。 这些性质在磷酸化后发生变化，这使得可以通过波长变化 (量子产率增加、减少或两者兼而有之) 进行分析。 生物传感器主要有四种类型：环境敏感型、深度猝灭型、自报告型或金属螯合增强型。
环境敏感型生物传感器通常具有与磷酸化肽复合的磷酸特异性氨基酸结构域。 这种类型的生物传感器通常用于 Ser/Thr 或 Tyr 磷酸化。 当被激活时，荧光会增加七倍。
深度猝灭生物传感器具有非共价连接的猝灭剂，该猝灭剂屏蔽荧光，直到磷酸化。 当分子被磷酸化时，生物传感器获得磷酸特异性氨基酸，将猝灭剂与荧光团分离，导致荧光增加。 这通常导致荧光增加约 64 倍。
自报告生物传感器用于检测酪氨酸磷酸化。 例如，酪氨酸可用于通过 π-π 堆积相互作用来猝灭荧光团。 当磷酸化时，猝灭消失，荧光增加五倍。
最后，金属螯合增强型生物传感器使用非天然氨基酸 Sox、螯合增强型荧光团以及一系列针对蛋白质激酶活性的生物传感器，这些生物传感器对 Mg2+ 有反应。 这些通常在磷酸化后荧光增加八倍。
这些生物传感器通常用于体外激酶测定，并允许检测初始滞后阶段。 这些生物传感器通常还监测多种激酶的活性。 还有可能使用这些生物传感器来分析活细胞测定[检查拼写]，但这些更困难。 虽然这些方法对于分析蛋白质激酶很好，但由于它们依赖于专用设备，而且肽的不稳定性和细胞扰动可能发生，因此它们并没有像人们认为的那样被广泛采用。
FRET (代表 Förster (荧光) 共振能量转移) 是一种描述蛋白质之间能量转移的机制。 大多数成像技术在将生物传感器导入活细胞时存在困难，或者存在限制其使用的局限性。 基于 FRET 的报告基因通常克服了进入细胞的困难，因为它可以让细胞自行制造生物传感器。 这些报告基因是遗传编码的，可以作为 DNA 转移到细胞中。 这些遗传编码生物传感器的一个显著例子是 GFP (绿色荧光蛋白)。 FRET 的变化可以看作是荧光团荧光发射率的变化；这通常是供体和受体荧光团发射之间的变化。
FRET 成像通过使用 FLIM (荧光寿命成像显微镜) 来完成供体的光化学性质，FLIM 检测到存在受体的情况下供体 FRET 对的荧光衰减缩短。 这是有利的，因为寿命测量与荧光团浓度和光漂白无关，并且允许区分实际的 FRET 效率和探针浓度。
选择 FRET 对以产生最大的动态范围。 选择结构域基于要由生物传感器检测的磷酸氨基酸。 生物传感器的底物部分控制着报告基因的特异性。 这通常是一个短的共有肽，可以被目标激酶特异性识别和有效磷酸化，但对其他激酶来说是惰性的。 该方法已经产生了大量成功遗传编码的生物传感器。 这些还被修改为包含其他特征，例如靶向细胞特定区域的序列或在细胞内生成更多代的生物传感器。
这些基于 FRET 的生物传感器为我们提供了一种比以前更有效、更有效地对活细胞中的磷酸化进行成像的方法。
与基于肽的生物传感器相比，基因编码的报告蛋白可以提供足够的灵敏度，并且能够提供关于磷酸化和信号通路调控的更多有用信息。这些报告蛋白可用于研究特定的激酶并影响其活性。还可以将特定报告蛋白靶向，以发现特定蛋白磷酸化与细胞其他特征之间的关联。
激酶报告蛋白最令人兴奋的应用之一是通过高通量化学筛选。这可以帮助制药公司，因为报告蛋白可以确保化合物能够有效地进入细胞并提供蛋白质抑制的动力学信息。这是一个重大的改变，因为这些筛选通常是在体外进行的，目前尚不清楚这些化合物是否可以靶向细胞内的激酶。通过使用细胞内激酶报告蛋白，研究人员已经能够鉴定出几种新型的蛋白激酶A (PKA) 抑制剂。所有这些都是通过分析荧光共振能量转移 (FRET) 完成的。
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