结构生物化学/克雷布斯循环（柠檬酸循环）
柠檬酸循环有八个步骤。
柠檬酸循环的另一个名称是三羧酸 (TCA) 循环或克雷布斯循环。柠檬酸循环是细胞的中心代谢核心。它是氧化（换句话说，是收集高能电子）——例如碳水化合物、脂肪酸和氨基酸——的最终共同途径，它们通过进入循环作为乙酰辅酶 A (CoA) 来进行。该反应发生在线粒体内部。它非常有效，因为它可以产生大量的 NADH 和 FADH。柠檬酸循环提供了有氧人体细胞使用的能量的绝大部分（90%）。通过作为细胞呼吸的第一阶段，柠檬酸循环产生的高能电子反过来被用于氧化磷酸化以还原 O2，产生质子梯度，并随后合成 ATP。
碳水化合物主要通过糖酵解被加工成丙酮酸。取决于生物体，丙酮酸在厌氧条件下被转化为乳酸或乙醇。通过嵌入线粒体膜中的特定载体蛋白，丙酮酸在有氧条件下被转运到线粒体中。然后，丙酮酸被丙酮酸脱氢酶复合物氧化脱羧，以便在线粒体基质中形成乙酰 CoA。该反应如下所示
丙酮酸 + CoA + NAD+ → 乙酰 CoA + CO2 + NADH + H+
这是一个不可逆反应，它将糖酵解和柠檬酸循环联系在一起。如所示，CO2 由丙酮酸脱氢酶复合物产生，它以 NADH 的形式捕获高转移势电子。因此，丙酮酸脱氢酶与柠檬酸循环本身的反应有关。丙酮酸脱氢酶复合物由三种不同的酶组成。它的复合物由同源复合物家族的成员组成，其中包括柠檬酸循环酶 α-酮戊二酸脱氢酶复合物。这些复合物非常大，甚至比核糖体还大，其分子量介于 400 万到 1000 万道尔顿之间。
- 乙酰-CoA 是有氧呼吸中丙酮酸脱氢酶复合物的主要产物，它启动了克雷布斯循环。（它是糖酵解和柠檬酸循环之间联系的不可逆反应。）从丙酮酸合成乙酰辅酶 A 的机制需要五个辅酶和三种酶。这是一个非常复杂的机制，其中许多酶和辅酶。作为底物起作用的辅因子分为两种不同的辅因子：催化辅因子和化学计量辅因子。催化辅因子包括辅酶，如硫胺素焦磷酸 (TPP)、硫辛酸和 FAD。化学计量辅因子包括辅酶，如 CoA 和 NAD+。丙酮酸通过三个不同的步骤转化为乙酰 CoA，包括：脱羧、氧化和将所得的乙酰基转移到 CoA。
丙酮酸通过三步反应形成乙酰-CoA
1. 脱羧：TPP 与丙酮酸结合并脱羧以产生羟乙基-TPP。在丙酮酸脱氢酶成分中，TPP 被称为辅基，其中噻唑环中氮和硫原子之间的碳原子比大多数双键碳基团的酸性更强，其 pKa 值接近 10。此反应由多酶复合物的 (E1) 丙酮酸脱氢酶成分催化。位于 TPP 中的碳中心被电离以形成一个碳负离子，它被添加到丙酮酸的羰基。作为脱羧的一部分，TPP 的带正电荷的环稳定了转移到环上的负电荷。最后，质子化产生羟乙基-TPP。
Pyruvate + TPP( conenzyme thiamine pyrophosphate)+ 2 H+ --> Hydroxyehthyl-TPP + CO2
2. 氧化：为了形成乙酰基，与 TTP 相连的羟乙基被氧化。同时，羟乙基被转移到硫辛酰胺，它是衍生自硫辛酸的，通过酰胺键与赖氨酸残基的侧链相连。这产生了能量丰富的硫酯键的形成。在这个反应中，硫辛酰胺的二硫键充当氧化剂，并被还原成二硫醇形式。此反应也由丙酮酸脱氢酶成分 (E1) 催化，并产生乙酰硫辛酰胺。
Hydroxyethyl-TPP + Lipoamide --> TPP + Acetyllipoamide
3. 乙酰 CoA 的形成：乙酰 CoA 的形成：在此步骤中，当乙酰基从乙酰硫辛酰胺转移时，乙酰 CoA 形成。此反应由二氢硫辛酰胺转乙酰酶 (E2) 催化。当乙酰基被转移到 CoA 时，能量丰富的硫酯键被保留。因此，柠檬酸循环的燃料，乙酰 CoA 已从丙酮酸生成，用于使用。直到二氢硫辛酰胺被氧化成硫辛酰胺，丙酮酸脱氢酶复合物才能完成另一个催化循环。
CoA + Acetyllipoamide --> Acetyl CoA + Dihydrolipoamide
4. NADH 的形成：该反应的最后一步发生在二氢硫辛酰胺脱氢酶 (E3) 使硫辛酰胺的氧化形式再生时。两个电子首先被转移到酶的 FAD 辅基，然后被转移到 NAD+。这种电子转移过程非常不寻常，因为已知 FAD 从 NADH 中接收电子，而不是将电子转移出去。在酶内，FAD 的电子转移势能因其化学环境而增加，使其能够将电子转移到 NAD+。黄素蛋白是与 FAD 或 FMN（也称为黄素单核苷酸）紧密结合的蛋白质。
Dihydrolipoaminde + FAD --> Lipoamide + FADH2 + NAD+ --> FAD + NADH + H+
总反应
Pyruvate + CoA + NAD+ --> acetyl CoA + CO2 + NADH +H+
1. 循环的第一个反应是乙酰-CoA 与草酰乙酸缩合形成柠檬酸。在这个反应中，乙酰基与草酰乙酸的羰基相连。乙酰-CoA 与草酰乙酸之间的反应对于形成用于水解的活性位点封闭的柠檬酰 CoA 复合物是必要的，因为乙酰-CoA 与水解的活性位点是一个浪费的过程。
Oxaloacetate + Acteyl-CoA --> Citryl-CoA + H2O -->Citrate + CoA
2. 通过顺乌头酸形成异柠檬酸：酶，乌头酸酶催化柠檬酸可逆转化为异柠檬酸。这实际上是一个两步机制，它交换了氢与羟基。首先，柠檬酸脱水以形成三羧酸顺乌头酸的中间形成。然后，通过使用相同的酶乌头酸酶，异柠檬酸形成。乌头酸酶是一种铁硫蛋白，参与底物的脱水和再水化。
Citrate <-(forward rxn removes water)-> cis-Aconitate <-(forward react with water)-> Isocitrate
3. 用 NAD+ 氧化异柠檬酸为 α-酮戊二酸、CO2 和 NADH。异柠檬酸脱氢酶催化异柠檬酸氧化脱羧生成 α-酮戊二酸。Mg2+ 用于与草酰琥珀酸的羰基相互作用。α-酮戊二酸的形成速率决定了柠檬酸循环中总反应的速率。中间体草酰琥珀酸是一种非常不稳定的 β-酮酸。与中间体的反应
Isocitatrate + NAD+ --> Oxalosuccinate + NADH + H+ Oxalosuccinate + H+ --> CO2 + α-ketoglutarate
总反应
Isocitrate + NAD+ --> α-ketoglutarate +CO2 + NADH
4. 将 α-酮戊二酸氧化为琥珀酰-CoA 和 CO2。这是另一个氧化脱羧反应。α-酮戊二酸在 α-酮戊二酸脱氢酶复合物的作用下被转化为琥珀酰-CoA 和 CO2。NAD+ 用作电子受体，CoA 用作琥珀酰基的载体。该反应实际上与丙酮酸脱氢酶反应相同。此步骤中参与了三种酶。这类似于丙酮酸脱氢酶复合物反应。
α-ketoglutarate+ CoA + NAD+ -(α-ketoglutarate dehydrogenase complex)-> succinyl-CoA + CO2A +NADH
5. 将琥珀酰-CoA 转化为琥珀酸：琥珀酰-CoA 具有硫酯键。硫酯键保留了大量的能量 (ΔG° = -33.5 kJ mol -1。通过断开硫酯键释放能量。此步骤中使用的酶称为琥珀酰-CoA 合成酶或琥珀酸硫激酶。键的断裂与 GDP 磷酸化相耦合。
Succinyl CoA + Pi + GDP --> succinate + CoA + GTP
6. 将琥珀酸氧化为延胡索酸：从琥珀酰-CoA 形成的琥珀酸被琥珀酸脱氢酶氧化为延胡索酸。FAD（连接到组氨酸侧链）通过从琥珀酸中去除两个氢来充当电子受体。FADH2 将其电子传递给辅酶 Q，辅酶 Q 将被用于电子传递链。
His-FAD + succinate <--> His- FADH2 + fumarate
7. 将延胡索酸水化为苹果酸：然后延胡索酸通过使用延胡索酸酶转化为苹果酸。这种酶具有高度立体特异性；它催化延胡索酸的顺式双键的水合。该反应通过添加 H+ 和 OH- 来制备 L-苹果酸。
Fumarate + H2O --> L-Malate
8. 在最后一步中，苹果酸 (C4) 在苹果酸脱氢酶催化的氧化还原反应中被氧化为草酰乙酸 (C4)，而 NAD+ 被还原为 NADH。该反应非常正，ΔG° = +29.7 kJ mol -1。
Malate + NAD+ <--> oxaloacetate + NADH + H+
9. 然后，只要氧气被转运到细胞中，克雷布斯循环就会再次重新开始。
请注意，碳的数量从一开始的 4 和 2 的总和变为 6、6、5、4、4、4，然后又回到草酰乙酸 (C4)。总的来说，由丙酮酸脱氢酶复合物产生的两个乙酰-CoA 分子产生了 6 个 NADH、2 个 FADH2 和 4 个 CO2。
由于已知丙酮酸脱氢酶复合物的全部复杂结构，因此可以构建原子模型，从而能够从模型中了解其活性。复合物的中心是由转乙酰酶组分 E2 形成的。转乙酰酶包含八个催化三聚体，它们聚集在一起形成一个空心立方体。每个形成三聚体的三个亚基都具有三个主要结构域。氨基末端包含一个小的结构域，该结构域包含一个结合的灵活的硫辛酰胺辅因子，该辅因子连接到赖氨酸残基。该结构域与生物素结合结构域（如丙酮酸羧化酶）同源。硫辛酰胺结构域之后是一个小的结构域，该结构域与复合物中的 E3 相互作用，较大的转乙酰酶结构域完成了 E2 亚基。E1 被认为是 α2β2 四聚体，而 E3 被认为是 αβ 二聚体。E2 被多个 E1 和 E3 的拷贝包围。这三个不同的活性位点通过 E2 亚基的长而灵活的硫辛酰胺臂协同工作，该臂将底物从一个活性位点传递到另一个活性位点。硫辛酰胺在不同活性位点之间移动的过程是：
1）在 E1 的活性位点，丙酮酸脱羧并形成羟乙基-TPP 中间体，而 CO2 作为第一个产物离开。活性位点通过 E1 复合体内的长疏水通道连接到酶的表面。
2）E2 将硫辛酰胺臂插入到 E1 的深通道中，该通道通向活性位点。
3）E1 催化乙酰基转移到硫辛酰胺。乙酰化的臂离开 E1 并进入 E2 立方体，以便访问 E2 的活性位点。该活性位点位于立方体内部深处，靠近亚基界面。
4）然后将乙酰基转移到 CoA。第二个产物（即乙酰辅酶 A）离开立方体。还原的硫辛酰胺臂然后摆动到 E3 黄素蛋白的活性位点。
5）在 E3 活性位点，硫辛酰胺被辅酶 FAD 氧化。重新活化的硫辛酰胺准备开始新的反应循环。
6）最终产物 NADH 是通过 FADH2 到 FAD 的重新氧化而产生的。
- 由于三种不同类型的酶的结构整合以及长而灵活的硫辛酰胺臂，这种复杂反应的协调催化成为可能。由于一种酶与另一种酶的接近，总体反应速率提高，副反应最小化。在整个反应序列中，丙酮酸氧化脱羧的所有中间体都保持与复合物结合。这很容易转移到 E2 的灵活臂上，依次调用每个活性位点。
虽然可以通过丙酮酸形成葡萄糖，但丙酮酸转化为乙酰辅酶 A 的不可逆步骤导致乙酰辅酶 A 无法转化回葡萄糖。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶 A 使葡萄糖的碳原子面临两种主要命运：通过柠檬酸循环被氧化成 CO2，同时产生能量，或者被整合到脂类中。丙酮酸脱氢酶复合物的活性受到严格控制。该反应可以被高浓度的反应产物抑制：通过直接结合，乙酰辅酶 A 抑制转乙酰酶组分 E2，而 NADH 抑制二氢硫辛酰胺脱氢酶 E3。高浓度的 NADH 和乙酰辅酶 A 通知酶，细胞的能量需求已经满足，或者为了产生乙酰辅酶 A 和 NADH，脂肪酸正在被降解，因为大多数丙酮酸是由糖酵解产生的葡萄糖衍生而来的。共价修饰在调节真核生物中的复合物方面非常重要。丙酮酸脱氢酶组分 (E1) 被丙酮酸脱氢酶激酶 I (PDK) 磷酸化关闭了复合物的活性。丙酮酸脱氢酶磷酸酶逆转了这种失活。
在动物细胞中，柠檬酸循环的速率受到调节，以适应对 ATP 的需求。循环中进行变构调节的两种酶是异柠檬酸脱氢酶和 α-酮戊二酸脱氢酶，它们都在循环中产生高能电子。
异柠檬酸脱氢酶被 ADP 刺激，ADP 增加了酶对底物的亲和力。由于异柠檬酸、NAD+、Mg+ 和 ADP 是协同的，因此这些底物的结合受到调节。如果不需要能量，将会有更多 NADH 和 ATP，它们将分别与 NAD+ 和 ADP 竞争酶的结合。由于反应需要正能量或电子受体，反应会减缓，直到需要像 ATP 和 NADH 这样的高能物质。
α-酮戊二酸脱氢酶是另一个变构酶，它调节柠檬酸循环的速率以适应 ATP 的需求。该酶被琥珀酰辅酶 A 和 NADH 抑制，它们也是产物，它们也与反应物竞争结合。α-酮戊二酸也被高能电子抑制。