结构生物化学/环境中重组DNA的测定方法

A. 导言

重组DNA技术的最大贡献之一是能够操纵微生物的DNA。这种也被称为重组DNA (rDNA) 技术的DNA操作涉及将来自不同生物体的DNA片段插入不同的宿主（rDNA宿主）中。这通常通过使用载体来实现，载体允许DNA在宿主细胞中复制，从而产生新的操纵的微生物。因此，操纵微生物的做法一直是数百家公司、实验室，甚至政府机构的研究重点。DNA微生物操纵成为如此热门的研究主题的原因在于其在经济层面的潜在效益。操纵的微生物的潜在用途包括：作为降解环境污染物、杀虫剂的生物体、为农作物提供保护、在医学领域等。然而，转基因微生物（GEM）的释放一直是一个备受争议的话题。人们担心的是，将基因改造的微生物添加到环境中会带来什么样的影响。主要的担忧有两个方面：1. 宿主细胞可能含有最初未知的致病基因，对所有生物体构成威胁。2. 改造后的生物体可能对生态系统产生影响，尤其是在进化方面，使某种生物体相对于其他生物体具有优势，从而可能改变诸如营养循环、能量流动和生态系统等因素。这就是为什么必须对将转基因微生物（GEM）添加到环境中进行仔细研究和监管。因此，田纳西大学的三位研究人员开展了研究，以确定环境中的基因改造微生物。

B. rDNA环境监测的要求

为了使用一种技术方法来观察和寻找环境中的基因改造微生物，首先必须提出一系列问题，以确定该方法是否有效和/或是否为一种现实的技术。

1. 它应该适用于各种环境条件。2. 它在技术应用方面应该简单易行。3. 它应该能够检测、识别和计数GEM。4. 它应该具有灵敏度和特异性，能够检测到少量种群。5. 它应该能够将特定的GEM与环境中的其他生物体区分开来。6. 它应该能够将GEM与同一物种的其他菌株区分开来。7. 它应该高效、经济且省时。

这些方法反映了田纳西大学的三位科学家所确定的规则。

C. 常规方法

I. 选择性培养和富集技术

微生物选择性培养的过程涉及选择性培养基的存在。选择性培养基可以根据物理生长条件（温度、氧气浓度）或成分进行区分。在检测微生物的rDNA方面，培养只选择rDNA宿主，而不是特定的rDNA序列。使用复杂培养基来适应rDNA宿主的复杂性，从而能够区分非重组菌株。此外，这种技术只被认为是一种初步技术，因为它必须被认为是推定的，需要确认rDNA的存在。

II. 最可能数 (MPN) 方法计数

在这种方法中，首先将样品稀释至灭绝，然后使活细胞在适当的培养基试管中生长。然后，进行概率理论来确定种群的原始密度。使用的培养基决定了选择或富集以及物种的生长和活性，因此它是另一种区分方法。然而，这种方法也有一些缺点，包括为了提高精确度，需要使用大量稀释液和试管。

III. 荧光显微计数技术

该技术涉及将细菌浓缩到膜过滤器上，然后对细菌进行染色，然后通过显微镜计数细菌。由于该技术缺乏其他常规技术的特异性，因此目前不再广泛应用于GEM检测。

常规方法的弱点

1. 弱点是该技术缺乏特异性。2. 该技术需要目标生物体的生长，因此如果生物体在采样时受到压力，则会低估或产生假阴性结果。3. 没有通用的培养基能够使样品中所有潜在的宿主生物体生长。

D. 开发中的方法

I. 免疫技术 - 该技术涉及使用抗体（多克隆和单克隆抗体）来识别GEM，提供一种灵敏且特异的技术。

II. 酶联免疫吸附测定 (ELISA) - 这种生化技术涉及使用特定的抗体来寻找特定的抗原，反之亦然，即使用特定的抗原来检测特定的抗体。该过程灵敏且特异，这可能反映了其在定位GEM（基因改造微生物）方面的价值。

III. 放射性标记 - 该技术涉及一些放射性物质的偶联，这使得转基因微生物能够被放射性标记。然而，主要缺点是成本高，需要大量的放射性物质。

IV. 荧光标记 - 该技术还涉及使用与荧光染料偶联的抗体。将抗体添加到感兴趣的样品中，因此可以通过荧光显微镜观察。

V. 使用质粒流行病学和限制性片段长度多态性 (DNA指纹图谱) - 该技术是一种通过专门研究微生物的质粒来研究特定转基因微生物的方法。通过琼脂糖凝胶电泳分离质粒，并通过溴化乙锭染色凝胶，在紫外光下观察。

VI. 使用可选择的基因型标记 - 可以使用两种不同的标记来研究GEM

1. 显色标记

2. 抗体或抗性标记 - 许多这些标记存在于质粒或转座子中，可以整合到细菌染色体中。

这些标记可以放置在微生物的质粒或染色体上。

VII. 使用核酸序列分析

VIII. 核酸杂交技术

IX. DNA：DNA菌落杂交

X. 南方印迹杂交

XI. 核酸与DNA提取物的杂交

XII. DNA：RNA杂交

XIII. 使用生物素化探针

参考文献 Burlage R, Jain R, Sayler G. "环境中重组DNA测定方法." 生物技术评论, 8:1-33-84.