结构生物化学/非核糖体肽合成酶 (NRPSs)

什么是非核糖体肽合成酶 (NRPSs) 以及它们制造了什么？

-NRPSs 是组装肽的大型、多模块催化剂。

-NRPSs 不是核糖体，但它们合成肽。

-NRPSs 制造的肽被称为非核糖体肽 (NRPs)。

-NRPSs 催化的反应是立体特异性和区域特异性的。

-NRPs 具有许多临床应用，包括抗生素、抗肿瘤药和抗真菌药。

-NRPs 是细菌和真菌产生的次级代谢产物。

NRPS 的结构是什么？

-NRPSs 由模块组成。

-每个模块将一个单体整合到 NRP 产物中。

-每个模块可以细分为催化域。

-大多数 NRPSs 上发现的四个催化域是

腺苷酸化 (A) 域
硫酯化 (T) 或肽酰载体蛋白 (PCP) 域
缩合 (C) 域
硫酯酶 (TE) 域

-每个域的功能和反应将在下面讨论。

-关于每个域的知识是通过核磁共振和 X 射线晶体结构研究获得的。

-短杆菌肽合成酶 (GrsA) 已被用于研究 A 和 T 域。

A 域

-激活氨基酸。

-大约 550 个氨基酸构成一个 A 域。

-非常选择性的“守门人”：只允许某些单体整合到 NRP 产物中。A 域的选择性由 10 个氨基酸赋予，这些氨基酸负责 A 域活性位点的底物结合。每个整合到 NRP 产物中的氨基酸都有一个特定的 A 域。

-A 域从开放构象开始，据推测能够与氨基酸和 ATP 结合。当底物（氨基酸、Mg²⁺ 和 ATP）对接时，形成腺苷酸化中间体。当 ATP 的磷酸酯键同时被裂解并形成氨酰腺苷酸和焦磷酸盐释放时，会产生 A 域闭合构象。然后，活化的氨基酸转移到 PCP 域，A 域恢复到其开放构象。

-A 域可以独立催化氨基酸活化，而无需与其他域连接。

GrsA 研究

-GrsA 的 A 域已在大肠杆菌中表达，其 3D 结构已解出，它被描述为由两个折叠的亚域组成。

-GrsA 的 A 域在结构上类似于萤火虫荧光素酶，尽管这些蛋白质只有 16% 的相同一级结构。

T/PCP 域

-传播生长的肽链。

-大约 100 个氨基酸构成一个 PCP 域。

-PCP 域必须能够到达参与肽延伸的 A 和 C 域。

-PCP 域可以存在于三种不同的构象中：脱辅基 (A)、脱辅基/全辅基 (A/H) 或全辅基 (H)。PCP 域通过翻译后用 4’-磷酸泛酰巯基乙胺 (ppant) 辅因子进行引物从脱辅基形式转化为全辅基形式。. 这种修饰发生在 PCP 域上一个保守的丝氨酸残基处，由 ppant 转移酶（如枯草芽孢杆菌 ppant 转移酶 Sfp）进行。

C 域

-通过缩合反应连接氨基酸。

-大约 450 个氨基酸构成一个 C 域。

-具有 V 形结构：两个大小相等的亚域通过 V 底部的铰链区域和 V 中间的环连接起来。催化活性氨基酸也位于 V 的中间。V 形允许夹在 C 域之间的 PCP 域定位缩合底物。

-对 C 域的数据库分析并未表明具有相似活性的同源酶。然而，在肽合成酶超家族中，C 域彼此同源。

TE 域

-通过水解或大环化释放肽产物。

-大约 250 个氨基酸构成一个 TE 域。

-编码细菌 TE 域的基因与编码哺乳动物细胞脂肪酸生物合成 TE 域的基因同源。

-在 TE 域中发现了一个保守的天冬氨酸残基。

从结构域构建新产品

-由于结构域负责 NRP 产物形成中的离散功能，因此有可能将结构域混合和匹配在一起以生成一个模板，该模板可以制造新的 NRP 产物。对结构域的结构和生化功能的了解推动了构建这种模板的可能性。

-在修改现有 NRPS 系统方面取得了进展，但尚未实现完全工程化的模板。

-设计的模板必须包含正确顺序和数量的激活模块。

-修改现有 NRPS 系统的一种方法是通过改变氨基酸激活模块来实现。改变模块的重组方法包括两个步骤。对编码激活模块的基因进行靶向，并用一个杂合基因替换。杂合基因编码一个识别不同底物的新的激活模块。新的底物特异性导致 NRP 产物中被取代的不同氨基酸。这种方法成功地用于重新改造在枯草芽孢杆菌中发现的表面活性素合成酶。

-两步重组需要关于被靶向的 NRPS 系统的遗传信息。只有少数 NRPS 系统在遗传水平上得到了充分的表征。肽合成酶基因鉴定的进展得益于肽合成酶域中基序结构的保守性。

-由于 NRPS 产物的随机改变不太可能增强其所需的特性，因此建模工具可能有助于指导 NRPS 工程工作。

关于 NRPSs 的剩余问题

-活化的氨基酸从 A 域转移到 PCP 域的机制是什么？

参考文献

Matthias Strieker、Alan Tanovic 和 Mohamed A Marahiel。非核糖体肽合成酶：结构和动力学。结构生物学 2010, 20: 234-240。

Mohamed A. Marahiel、Torsten Stachelhaus 和 Henning D. Mootz。参与非核糖体肽合成的模块化肽合成酶。化学评论 1997, 97: 2651-2673。