结构生物化学/核酸/含氮碱基/核糖核苷酸还原酶

核糖核苷酸还原酶（或 RNR）是一种催化核糖核苷酸还原为脱氧核糖核苷酸的酶。这些脱氧核糖核苷酸随后可以被细胞用于 DNA 复制。此外，由于 RNR 在脱氧核糖核苷酸的形成中所起的作用，RNR 负责调节细胞内 DNA 合成的速率。

RNR 类别

1. I 类：I 类 RNR 包含两个亚组（Ia、Ib 和 Ic），它们在一级结构上略有不同；然而，这两个亚组在含有两个不同的二聚体亚基（R1 和 R2）以及需要氧气才能形成稳定的自由基方面是通用的。Ic 类 RNR 是最近发现的，首次在沙眼衣原体中发现。证据还表明它存在于古细菌和真细菌中。Ic 类 RNR 的序列表明，三个亚组之间 PCET 通路和核苷酸还原酶活性位点的残基是相似的。
2. II 类：II 类 RNR 在腺苷钴胺素的帮助下形成硫醇自由基——腺苷钴胺素充当 R2 亚基作为自由基生成器的作用——并利用硫氧还蛋白或谷胱甘肽还原酶作为电子受体。因此，II 类 RNR 仅由一个亚基组成，并以单体或二聚体的形式存在，既不需要氧气，也不受氧气的抑制。
3. III 类：III 类 RNR 与 I 类 RNR 一样，由两个二聚体蛋白亚基（NrdG 和 NrdD）组成；然而，与 I 类 RNR 持续需要 R2 来产生自由基不同，小的 NrdG 只在 NrdD 激活期间需要。III 类 RNR 的机制使用甲酸作为电子受体，并产生对氧气敏感的甘氨酰自由基，从而使酶在氧气存在的情况下失活。

RNR 的自由基机制

尽管结构和电子受体存在差异，但所有三类 RNR 都是通过自由基机制进行的。 最终，RNR 催化一个反应，导致核糖的 2'-羟基被氢原子取代，从而产生脱氧核糖部分。

I 类 RNR 中的金属辅因子组装

尽管 I 类 RNR（Ia、Ib 和 Ic）具有相似的结构和途径，但 RNR 催化核苷酸转化为脱氧核苷酸的活性所必需的金属辅因子却存在显着差异。这些辅因子的产生机制，无论是在体外还是在体内，以及检查受损辅因子的修复方式，都表明了每个亚组对不同辅因子的依赖性。对这些金属辅因子的途径和激活的研究有助于我们了解生物学如何防止金属错配的发生，并以高产率配置簇形成。所有三种 I 类 RNR 共享一种常见的催化机制，其中金属辅因子直接或间接参与α的保守半胱氨酸氧化为硫醇自由基 S•)。I 类 RNR 氧化是通过 Ia 和 Ib 中的 Y• 发生的。

1. Ia 类：Ia 类 RNR 需要 FeIIIFeIII-Y• 辅因子。它位于 β2，位于疏水通道的末端，该通道是 O2 簇组装的假定通路。在大肠杆菌研究中，体内过程表明，将大肠杆菌的 apo-β2 与 FeII、O2 和还原剂一起孵育，导致 FeIIIFeIII-Y• 辅因子的自组装。此过程至少需要一种小的蛋白质或分子来将 FeII 递送至 apo-β2，并递送将 O2 还原为 H2O 所需的额外还原当量。这也可能是合理的，因为 Ia RNRN 比 FeII 更紧密地结合 MnII，因此需要某种伴侣蛋白来确保正确的金属化。
2. Ib 类：Ib 类 RNR 对 FeIIIFeIII-Y• 和 MnIIIMnIII-Y• 辅因子都有活性。该酶可以在体外形成活性 FeIIIFeIII-Y• 辅因子，但只有 MnIIIMnIII-Y• 辅因子被发现与体内相关。这种形成的机制被认为是通过一种称为 NrdI 的黄素蛋白氧化 MnIIMnII 中心而发生的，NrdI 是一种通过 O2 还原而产生的氧化剂。在大肠杆菌中，研究发现，当细胞中的铁含量过低时，锰辅因子会被诱导，这表明锰在这种和其他生物体中的重要性。还应考虑一定程度的生物体依赖性金属稳态变化，这可能有助于解释为什么一些生物体更频繁地依赖于任何一种辅因子。
3. Ic 类：Ic 类 RNR 由于其假定的双金属辅因子 MnIVFeIII 而不同于 Ia 类和 Ib 类 RNR。Ic 类 RNR 在其金属簇中储存一个电子氧化当量。Ic 的体外自组装类似于 Ia 和 Ib，它与 O2 和还原剂反应形成其各自的 MnIVFeIII 辅因子；然而，它与 2 当量的 H2 O2 反应形成活性辅因子也有所不同。Ic 类 RNR 已从其天然生物体中分离出来，这使其组装复杂化，因为两种不同的金属对蛋白质具有相似的亲和力。在沙眼衣原体的体外研究表明，调节金属的水平以及添加顺序是必要的。

在 I 类 RNR 的三个亚基中存在金属加载正确的問題。在 Ia 类 RNR 中，它需要 FeIIIFeIII-Y• 辅因子，但该蛋白质比 FeII 更紧密地结合 MnII。在大肠杆菌中，NrdB 的正确金属化依赖于游离 MnII 和 FeII 的存在，同时铁伴侣蛋白也存在以克服对 MnII 的结合偏好。Ib 类 RNR 中的問題是，它可能与 FeIIIFeIII-Y• 和 MnIIIMnIII-Y• 辅因子结合，但只有锰辅因子被发现与体内相关。Ib 结合取决于各个生物体的偏好以及它们固有的每种金属的浓度。Ic 类 RNR 使金属辅因子组装复杂化，因为它需要两种不同的金属，它们对同一种蛋白质具有相似的亲和力。调节两种金属的水平对于防止金属错配至关重要，其成功取决于两种金属的存在。在沙眼衣原体中，MnII 的缺乏或低于所需速率可能会导致二铁簇的形成。因此，如果这些水平没有得到调节，就会出现低活性、金属化不当，最终影响 DNA 合成。一般来说，如果 I 类 RNR 中任何必需金属的水平调节存在問題，就会导致低活性和金属化不当，最终影响 DNA 合成。

I 类 RNR 中的金属辅因子生物合成和修复

在研究不同金属和复杂程度的金属辅因子形成时，存在一些普遍的原则和挑战，总结如下。在金属酶研究中，需要考虑生理表达条件，以确认体外研究的蛋白质形式是否与体内活性形式相同。I 类 RNR 可以通过生物合成和修复途径控制活性金属辅因子的浓度。

1. 金属蛋白的辅因子是由特定的生物合成途径生成的。
2. 参与生物合成途径的蛋白质通常与目标金属蛋白的操作子相关联，并且可以通过比较基因组序列来分析某些因素。
3. 为了促进配体和蛋白质因子的交换，金属以其还原状态转移。
4. 存在多种蛋白质因子，包括：将金属递送至活性位点的金属插入酶或伴侣蛋白，控制金属氧化状态的特定氧化还原蛋白，以及帮助折叠和展开过程以使金属能够插入活性位点的 GTP 酶或 ATP 酶。
5. 由于影响途径因子的生物冗余，需要对多个基因进行缺失，以便在基因缺失实验中识别表型。
6. 金属向蛋白质的递送及其调节的层次结构被推断出来，但尚未完全了解。
7. 区室化（例如原核生物中的周质空间与胞质溶胶）和蛋白质对某些金属的优先结合亲和力是导致细胞水平上金属错配的两个可能因素。
8. 一些蛋白质尚未从其天然来源中分离出来，并且形成了异源表达系统，导致金属错配。由于最佳活性水平尚不清楚，因此对应于低活性的不正确簇可能无法被识别。
9. 某些氧化剂会导致金属簇的损伤（例如 NO 和 O2），并且在修复过程中使用特定的途径。
10. 在氧化状态发生变化期间，通常需要质子进行这种金属氧化。金属结合的配体可以轻松重组，羧酸盐配体的重组对于簇组装过程至关重要。

最大的难题之一是，特定蛋白质结合所需的金属元素往往不是与之亲和力最高的金属元素。Irving-Williams 系列（MnII < FeII < CoII < NiII < CuII > ZnII）最能描述蛋白质对二价金属的相对亲和力，此外还取决于金属结合发生的特定蛋白质配位环境。对于系列中后期的金属，存在伴侣蛋白来帮助它们移动到活性位点，而细胞内它们可能以低浓度的“游离”金属形式存在。除了递送之外，这些伴侣蛋白还有另一个功能，即帮助维持这些金属的游离浓度处于较低水平，以防止错配金属化和在需要 MnII 和 FeII 的其他蛋白质之间发生结合。细胞区室化可以克服蛋白质的结合偏好，因为某些活动发生在细胞的不同部位，这些部位具有并需要不同数量的金属元素。在蓝藻中，发现 MnII 依赖性的胞外蛋白必须在细胞质中折叠，在细胞质中 MnII 的自由量高于 ZuII、CuI 和 CuII。

研究 RNR 活性的技术

实验室中有一些技术用于监测 RNR 金属辅因子的活性。这有助于通过研究这些辅因子的运动来确定准确的提议机制、产生和功能，这些机制是在体外和体内进行的。

1. 全细胞电子顺磁共振：EPR 用于研究酿酒酵母中 FeIIIFeIII-Y• 的生物合成。发现 Y• 水平在各种生长条件下都足够高，并且可以在内源水平上检测到，这意味着 Y• 不会随着细胞周期的变化而调节。需要一个小的分子或蛋白质因子来快速还原细胞裂解物中的 Y•，这表明存在一个金属辅因子，后来被鉴定为铁。
2. 穆斯堡尔谱：这种类型的谱学监测铁从氧化和还原铁库到 RNR 辅因子的移动。它允许同时检测铁的所有氧化态，并且对存在于铁物种周围的电子环境敏感。为了使这种技术准确，细胞首先需要用 Fe57 同位素标记。