结构生物化学/核酸/RNA/短RNA测序

引言

短RNA包括不同类别的分子，如小核RNA、微RNA和转移RNA等。许多功能性RNA由于在基因序列的启动子和3'末端发现了短RNA，因此被较少地表征为短RNA。它还涉及参数突变，是基因座上两个等位基因之间的相互作用，导致另一个等位基因发生分子间变化。短RNA可以在研究领域中进行研究，以描述和分析开发具有单分子测序（SMS）的短RNA物种的策略和过程，以及其在许多实验室研究中的效率。短RNA来源于细胞中功能性前体RNA物种的最终产物。细胞中短RNA物种的一个例子可以在DNA序列中的基因剪接和3'端RNA加工中找到，用于合成生长较长的mRNA。然而，许多与非蛋白质编码功能性RNA相关的类别很可能来自比生长较长的mRNA更长的前体。为了将RNA分馏成物种，一些方法被用于研究短RNA的各种功能。例如，Philipp Kapranov博士及其研究人员使用Helicos单分子测序方法来研究细胞中短RNA的细节。

短RNA的RNA分离

为了进行RNA的分离，使用mirVana miRNA分离试剂盒和miRNeasy Mini试剂盒（也称为Qiagen）从总RNA（培养细胞）中纯化sRNA。RNA试剂盒用于大量sRNA（来自培养细胞）的制备。通过这种RNA/DNA试剂盒方法，特定组分的sRNA通过TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶的洗脱和电泳方法进行纯化。电泳是由于整个细胞结构中空间均匀的电场导致流体中粒子扩散的作用。

分析短RNA的困难

在科学家和研究人员中，研究短RNA极具挑战性。一些难题挑战着研究短RNA的研究人员：1）必须成功分离出具有所需长度范围的特定sRNA。2）对具有分子手柄（如用于自身转化为cDNA的mRNA的3'PolyA尾）的sRNA缺乏兴趣。3）sRNA有时太短，无法有效且成功地用六聚体转化为cDNA。4）一些特定的sRNA在其5'和3'末端的基因序列上具有修饰，这些修饰会干扰随后的分子操作的读取；因此，一些sRNA经常无法被许多研究人员使用的方法检测到。5）某些sRNA具有牢固的2'结构，阻止自身被研究人员在非变性条件下经常进行的酶促方法检测到。6）某些sRNA（如miRNA）长度很短，无法有效地用于复杂基因组的映射；因此，发现sRNA及其特定功能对于研究人员来说非常具有挑战性，他们需要研究和进行与sRNA相关的实验。7）许多方法依赖于使用连接过程和PCR扩增，这可能会错误地表示细胞结构中RNA物种的组成和定量。此外，8）sRNA组分可能主要由snRNA、rRNA和sno RNA等RNA类别高度存在（这将需要大量的复杂性才能完成细胞中sRNA群体的表征。研究sRNA最具挑战性的部分恰好是处理细胞中的物理结构：sRNA的短长度使研究人员难以进行实验。

sRNA组分的分离

使用多种方法，可以使用miRNeasy或DNA/RNA试剂盒（Qiagen）检测和分离sRNA组分。如果需要，可以通过使用TBE-尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳作为研究sRNA的科学家和研究人员的另一种替代方法，在特定尺寸范围内进行sRNA分离。研究sRNA的一种方法是使用3'PolyC对RNA进行尾部修饰：将RNA与水混合在PCR扩增管中，并将其与方案一起使用；然后，将sRNA在PCR仪中于85摄氏度孵育2分钟，并在冰上至少孵育2分钟。孵育后，向溶液中加入大肠杆菌Poly A聚合酶缓冲液并混合。用苯酚或氯仿或异戊醇重复提取sRNA两次，持续几秒钟；然后，加入100% EtOH（乙醇）纯化半小时，温度为零下80摄氏度。在4摄氏度下离心30分钟。然后，用70% EtOH洗涤，最后用水中复溶。

cDNA序列的制备

cDNA可以通过末端转移酶（TdT）方法在3'末端用poly-A聚合酶进行测序，并在另一个3'末端进行阻断。因此，cDNA可以结合到存在于细胞表面的oligo-dT上。此方法是方案和poly A方案的常用方法。如果预期cDNA浓度在5-10 ng的特定范围内，则使用常规NanoDrop在实验下分析一些cDNA。cDNA的尾部修饰部分如下：1）制备cRNA以在水中进行尾部修饰，并且根据其体积，其孵育时间和缓冲液量会有所不同。孵育后，将一定量的TdT缓冲液添加到cDNA溶液中；将cDNA在PCR扩增仪中于37摄氏度孵育1小时。将孵育的cDNA样品在95摄氏度加热5分钟。随后，添加TdT缓冲液并重复孵育以获得cDNA的最终序列，并测量样品中尾部修饰的cDNA的浓度。

参考文献

1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22144202
2. http://en.wikipedia.org/wiki/Electrophoresis