结构生物化学/克服蛋白质晶体学的挑战
因为膜蛋白仍然是结构生物学家最难的目标之一，因为所有细胞都有一个脂质双层，蛋白质嵌入脂质双层中，除了这些蛋白质，膜外通常还有结构域。这些蛋白质已被彻底研究，它们参与了呼吸、光合作用、信号转导和分子转运等一系列过程。
在 20-30% 的蛋白质组中，只有少数膜蛋白的结构通过 X 射线晶体学或核磁共振解析出来。在蛋白质数据库中，关于膜蛋白的 50,000 多个条目中，只有 1% 多一点的信息与膜蛋白有关。这个膜蛋白信息比例很小，可以得出结论，膜蛋白很难研究。由于膜蛋白具有疏水表面，这种特性使得它们只能用去垢剂一起从细胞膜中提取出来。这些膜蛋白也常常非常灵活和不稳定，这是一个重要的挑战，因为它在多个层面上（表达/溶解/结晶/数据收集/纯化/结构解析）都很难解决。
有一些已知的膜蛋白结构，它们要么是化学合成的（对于短肽），要么是纯化的（从天然来源），或者甚至重组产生的。例如，乳酸乳球菌、毕赤酵母、酿酒酵母和大肠杆菌都在昆虫细胞和哺乳动物细胞系中表达过。更具体地说，大肠杆菌的生产非常快、廉价且易于使用筛选，因此这会影响表达系统的成功。但对于真核蛋白，必须使用不同的系统——需要真核系统才能表达。首先，膜蛋白只有在被宿主细胞膜靶向的情况下才能正确折叠。其次，膜蛋白嵌入其中的脂质的性质和组成在不同的系统中会有所不同。因此，脂质性质对蛋白质稳定性的影响会影响结晶的可能性。第三，真核蛋白可能经历糖基化和其他修饰（翻译后）。39 种独特的真核膜蛋白中有 17 种是使用重组方法产生的，而另外 9 种来自酵母系统；昆虫细胞中还有 4 种，大肠杆菌中还有 4 种。
去垢剂在从宿主细胞膜中提取膜蛋白中起着重要作用，因为去垢剂能够包围蛋白质的疏水表面，从而使溶解发生。由于这一关键步骤，为这一纯化过程仔细选择去垢剂也很重要。去垢剂经过多次测试，测试其提取最大量可溶、活性、稳定的蛋白质的能力。但也有一些去垢剂在从膜中提取蛋白质方面很有效，但这些去垢剂在保证溶解的膜蛋白方面效率不高，例如 FOS-胆碱。因此，必须有满足多种特性的去垢剂；十二烷基麦芽糖苷 (DDM) 是一种特殊的去垢剂，用于从脂质双层中提取膜蛋白，它可以以相对便宜的价格以稳定方式提供溶解的膜蛋白。
在评估膜蛋白的表达和纯化方法方面取得了许多进展。Jan-Wilem De Gier 教授和 Eric Gouaux 介绍了一种在纯化过程中跟踪蛋白质的技术，即利用在该蛋白质的 C 端融合的 His 标签切割 GFP（绿色荧光蛋白）的能力。在大肠杆菌表达系统中，这种系统在目标膜蛋白具有胞质 C 端的条件下取得了成功；这是因为绿色荧光蛋白只有在胞质中才能发荧光，并且只有在胞质中才能正确折叠。因此，通过在 S. Cerevisiae 和大肠杆菌中表达的原核和真核绿色荧光蛋白融合蛋白，显示出用于大规模纯化的最高表达产量。很多时候，GFP 融合蛋白可能不需要先前的纯化，这可以通过凝胶荧光分析和荧光尺寸排阻色谱清楚地显示出来。
另一种在筛选许多膜蛋白表达和溶解构建体和条件的技术得到了解释，它最初是为进行小规模纯化的蛋白质解释的，更具体地说是对于 96 孔格式中的蛋白质。但从最初的解释来看，它已经发生了改变，以便能够识别菌落内的蛋白质表达；这种技术是通过菌落过滤印迹法在菌落被印到膜上后进行诱导表达，然后用各种测试去垢剂裂解细胞。一旦这些去垢剂溶解的蛋白质被过滤到整个膜中，它们就会被抗标签抗体检测到。找到膜蛋白更稳定的条件可能在结晶改善之前，但膜蛋白往往在去垢剂胶束中处于不稳定的状态。通常会添加脂质以保持稳定的溶解样品；凝胶过滤、电子显微镜或超速离心用于监测材料在筛选不同的缓冲液和去垢剂条件时的聚集状态。热稳定性也被研究作为监测蛋白质状态的一种手段。许多研究通过分析与附着在可访问的半胱氨酸残基上的染料的共价键的荧光来进一步推进。此外，最近的研究还表明，使用点突变提高 β1-肾上腺素能受体的稳定性，并测试由此产生的突变体的活性。
蛋白质结晶过程通过对大量可能被利用的试剂进行多次测试来实现。但这些最初的结晶条件不足以确定它是否完全最佳，直到获得良好衍射的晶体。在过去十年中，使用 100 nl 滴获得了必要的常规晶体筛选，尽管已经为可溶性蛋白质提供了许多 96 孔稀疏矩阵筛选系统，但这些系统都包含许多特定特性，其中蛋白质不太可能结晶在其中。因此，岩田小组设计了专门设计的结晶筛选，这些筛选是为优化膜蛋白的蛋白质结晶而准备的。在大量证据之后，已经证明，在结晶过程中筛选去垢剂是一个重要的过程。通过在结晶液滴中添加存在的去垢剂，可以提高晶体质量。因此，蛋白质分子可以以有序的方式形成晶体，这是由于三维连续脂质相的能力；这些类型的相允许膜蛋白在脂质中自由扩散，而不是将膜蛋白封闭在去垢剂胶束中。
在可溶性蛋白质晶体上的数据收集现在已成为一种常规操作，晶体被放置在样品更换器上，并自动收集数据。对于膜蛋白晶体来说，这种情况变得很困难，因为来自膜蛋白的晶体通常由于去垢剂胶束（去垢剂胶束会包围蛋白质的疏水部分）而含有很高的溶剂含量。因此，这些晶体由于其脆性且晶体质量很低而难以处理。这种类型的数据收集会导致需要筛选大量晶体。但由于同步辐射光束线具有自动样品更换功能，上述情况已得到解决，并能够高效快速地筛选许多晶体。从这些光束线上收集数据集，这些光束线从小的晶体中收集数据集，同时还从良好衍射区域收集数据。数据集还从晶体长度收集，即使有单个部分受到辐射损伤。由于膜蛋白的高溶剂含量，相位的巨大改进导致了溶剂平滑。
有大量证据表明，与可溶性蛋白质相比，膜蛋白的结构解析仍然存在许多特定挑战。但为了设计能够结晶的蛋白质并使这些蛋白质稳定，已经取得了各种进展。据推测，在未来几年，膜蛋白结构的数量将迅速增长，特别是真核膜蛋白。这些发现不仅有助于我们了解蛋白质在膜中的折叠和功能，而且还将提供大量关于未来新型药物潜在设计的信息。